參芪復方對GK大鼠胰島β細胞凋亡和誘導型一氧化氮合酶表達的影響

1、參芪復方對GK大鼠胰島細胞凋亡和誘導型一氧化氮合酶表達的影響        【摘要】  目的觀察參芪復方對自發(fā)性2型糖尿病動物GK大鼠（Goto-Kakizaki wister rats）胰島細胞凋亡的影響及其可能機制。方法選取4月齡SPF級雄性GK大鼠50只，隨機分為模型組、鹽酸二甲雙胍組、參芪復方低、高劑量組并另設正常Wister大鼠對照組。連續(xù)灌藥4周后，TUNEL染色觀察各組胰島細胞凋亡指數(shù)（AI），并采用免疫組化染色，Mias-2000圖像分析系統(tǒng)觀察各組大鼠胰島細胞誘導型一氧化氮合酶（iNOS

2、）陽性物質積分光密度。結果模型及低劑量組細胞AI較正常組顯著增高（P<0.01），各組AI顯著低于模型組（P<0.01），高劑量及二甲雙胍組細胞AI顯著降于低劑量組（P<0.01）且與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P0.05）；模型及低劑量組胰島iNOS陽性物質積分光密度顯著高于正常組（P<0.01），高劑量組、二甲雙胍組iNOS積分光密度顯著低于模型組（P<0.05），與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P0.05）。結論參芪復方能夠抑制GK大鼠胰島細胞凋亡，機制可能與其抑制細胞iNOS表達有關。 【關鍵詞】  參芪復方 GK大鼠 細胞 誘導型一氧化氮合酶 凋亡參芪復

3、方主要由人參、黃芪、山藥、山茱萸、生地、天花粉、丹參、制大黃等組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱生津，活血化淤的功效。以往研究顯示，參芪復方具有抗2型糖尿?。═2DM）早期動脈粥樣硬化、低度炎癥的作用1,2，但其對胰島細胞凋亡的影響未見報道。本研究觀察了參芪復方對自發(fā)性2型糖尿病動物模型GK大鼠胰島細胞凋亡的影響并初步探討了其可能機制。1  器材1.1   動物4月齡雄性SPF級自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠50只及正常Wistar大鼠16 只（院上海實驗動物中心提供），按23只/籠飼養(yǎng)于獨立通氣籠具（IVC）系統(tǒng)內。1.2   藥品與試劑參芪復方浸膏粉（1g

4、浸膏粉相當于原生藥10g，四川大學華西藥學院藥廠提供，批號20031008），鹽酸二甲雙胍片（天津太平洋制藥有限公司，批號：20040523），TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（博士德公司），誘導型一氧化氮合酶（iNOS）一抗、即用型SABC試劑盒（博士德公司）。1.3   儀器Mias-2000圖象分析系統(tǒng)（四川大學智勝軟件股份有限公司），OLYMPUS BX50型光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）等。2  方法2.1  分組方法GK大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，尾靜脈取血測隨機血糖，隨機血糖11.1 mmol/L者共6只剔除3，余44只按血糖由高到低排列編號依

5、據(jù)隨機分為模型組、二甲雙胍組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，另設普通Wistar大鼠正常對照組，每組11只。各組均喂飼普通飼料。2.2  給藥方法正常對照組和模型組予生理鹽水5ml/（kg·d）灌服；二甲雙胍組予鹽酸二甲雙胍125.0 mg/（kg·d），中藥低、高劑量組分別予參芪復方0.5，2.0 g/（kg·d），共28 d。2.3  觀察指標及檢測方法2.4  統(tǒng)計方法用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhanecs'T2統(tǒng)計方

6、法。3  結果3.1   一般狀況實驗過程中模型組3只大鼠、低劑量組和二甲雙胍組各1只大鼠死亡。其余各組大鼠無死亡。3.2  參芪復方對各組大鼠胰島細胞凋亡指數(shù)的影響見表1。模型組及低劑量組較正常組凋亡指數(shù)顯著增高（P<0.01），高劑量組及二甲雙胍組凋亡指數(shù)雖較正常組升高，但差異無顯著性(P>0.05)；各治療組凋亡指數(shù)較模型組顯著降低（P<0.01）；高劑量組及二甲雙胍組凋亡指數(shù)較低劑量組顯著降低（P<0.01）。表1  參芪復方對各組大鼠胰島凋亡指數(shù)影響比較（略）與正常組比較，P<0.01；與模型組比較，P&

7、lt;0.01；與低劑量組比較，P<0.013.3   參芪復方對各組大鼠胰島細胞iNOS表達影響見表2。模型組與低劑量組iNOS積分光密度較正常組顯著增高（P<0.01），高劑量組及二甲雙胍組積分光密度雖較正常組增高但差異無顯著性（P>0.05）；高劑量組及二甲雙胍組積分光密度較模型組顯著下降（P<0.05，0.01），低劑量組與模型組積分光密度差異無顯著性（P>0.05）；各治療組積分光密度差異無顯著性（P>0.05）。表2  參芪復方對各組大鼠胰島細胞iNOS表達影響比較（略）1    

8、60;    與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，P<0.05，P<0.014  討論    GK大鼠為國際公認的自發(fā)性非肥胖性2型糖尿病動物模型，由Goto等1975年通過對Wistar大鼠進行口服葡萄糖耐量試驗并篩選高血糖的個體進行培育而來，比目前普遍使用的飲食誘導胰島素抵抗加化學損傷胰島細胞的動物模型更符合T2DM 的病理生理，主要表現(xiàn)為胰島素分泌不足、葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，細胞數(shù)目減少，肝糖生成過多，肌肉和脂肪組織中度胰島素抵抗等典型2型糖尿病特征，在長期糖尿病之后，易患有各

9、種并發(fā)癥4，為研究2型糖尿病的一種較好的動物模型。    細胞凋亡（apoptosis）是由局部環(huán)境生理或病理性變化引起的、自身內部機制調節(jié)的一種主動的、按一定程序進行的細胞自發(fā)性死亡，它涉及一系列的基因激活表達及調控，是生物界重要的生命現(xiàn)象之一。過去認為胰島素抵抗在2型糖尿病病理生理機制中占主要位置，但近年研究表明，無論是肥胖還是非肥胖的2型糖尿病患者，與其體重指數(shù)相當?shù)姆翘悄虿∪巳合啾?，其胰島細胞數(shù)目明顯減少，胰島細胞凋亡發(fā)生率明顯高于正常人群，而兩組人群間胰島再生和分化過程并無明顯區(qū)別。這個結果高度提示胰島細胞凋亡數(shù)目減少在2型糖尿病患者胰島功能衰竭中發(fā)揮了

10、舉足輕重的作用5。延緩和（或）防止胰島細胞凋亡已成為糖尿病的一個重要方向。本研究證實參芪復方能顯著抑制GK大鼠胰島細胞凋亡，提示降糖作用不及西藥的中藥復方可能通過干預胰島細胞凋亡這一重要環(huán)節(jié)治療2型糖尿病。    NO是一種重要的內源性生物信使分子，由左旋精氨酸(L-Arg)在NO合酶(NOS)的作用下生成。在基因水平NOS分為神經(jīng)型NOS (nNOS )、內皮型NOS (eNOS)和誘導型NOS(iNOS) 3 種6。nNOS 和eNOS主要存在于神經(jīng)細胞和內皮細胞，其合成NO量少，起傳遞生物信息的作用，而iNOS是在誘生因素作用下，由巨噬細胞、中性粒細胞、胰島

11、細胞等產(chǎn)生，其活性不受Ca2+濃度的影響，其催化產(chǎn)生的NO量大，具有細胞毒性作用7，能直接誘導細胞凋亡8，9。本研究證實參芪復方可顯著減少GK大鼠胰島細胞iNOS的表達，以中藥高劑量組作用最明顯（P<0.01）。因此，我們認為降低胰島細胞iNOS表達，減少NO生成，抑制NO誘導的胰島細胞凋亡，可能為參芪復方抗胰島細胞凋亡的機制之一。    總之，本研究初步證實具有益氣養(yǎng)陰、活血化淤之功效的參芪復方可明顯改善GK大鼠胰島細胞凋亡，保護胰島細胞，其機制可能與抑制胰島細胞iNOS表達有關?！尽?#160; 1 張紅敏,陳世偉,謝春光,等.參芪復方抗自發(fā)性糖尿病GK

12、大鼠早期動脈粥樣硬化的作用機制J.中藥雜志,2006,31(15)：1272.2 張紅敏,陳世偉,謝春光，等.參芪復方對GK大鼠炎癥標志物的影響及機理探討J.中藥材,2006,29(3)： 249.3 黃 松.糖尿病動物模型研究現(xiàn)狀及進展J.廣西醫(yī)學, 2002, 24(1)：46.4 Picarel-Blanchot F, Berthelier C, Builbe D, et al. Imparied insulin secretion and excessive hepativ glucose production are both early events in the diabetic

13、 GK ratJ. Am J Physio1, 1996, 271(4pt1)：E755.5 Butler AB，Janson J, Bonner Weir S et al. Beta-cell deficit and in-creased beta cell apoptosis in humans with type 2 diabetesJ.Diabetes, 2003, 52(l)：102.6 高 博,尹桂山.神經(jīng)系統(tǒng)中的一氧化氮J.生物化學與生物物理進展,1999,26(1)：31.7 Nathan C, Me QW. Regulation of biosynthesis of nitric oxideJ. JBiol Chem,1994, 269(19):137258 K Fehsel, KD Kroncke, KL Meyer et al.Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytesJ.The Journal of Immunology, 1995, 155(6)：2858.9 Geng YJ, Hellstrand K