加減抵當(dāng)湯對胰島素抵抗大鼠肝臟胰島素受體基因表達(dá)的影響

1、加減抵當(dāng)湯對胰島素抵抗大鼠肝臟胰島素受體基因表達(dá)的影響         【摘要】  目的探討加減抵當(dāng)湯對IR大鼠肝臟InRmRNA表達(dá)的影響。方法造模大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、加減抵當(dāng)湯高、中、低劑量組、文迪雅組，用RTPCR方法檢測加減抵當(dāng)湯對IR大鼠肝臟InRmRNA表達(dá)的影響。結(jié)果加減抵當(dāng)湯高、中劑量組能明顯上調(diào)IR大鼠肝臟InRmRNA的表達(dá)（P005或P001）。結(jié)論加減抵當(dāng)湯能上調(diào)InRmRNA的表達(dá)，可能是其改善IR的機(jī)理之一。 【關(guān)鍵詞】  抵當(dāng)湯 胰島素抵抗 胰島素受體 基因

2、表達(dá)Abstract:Objective To explore the effect of modified Didang decoction on insulin receptor gene expression in liver in insulin resistance rats.Methods The insulin resistance rats were randomly divided into the control group, the model control group, the high, medium and low dosage of modified Didan

3、g decoction groups and Wendiya group.Reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to observe the effect of modified Didang decoction on the InRmRNA of liver in rats. Results The InR gene expression level was significantly higher in the high and medium dose of modified Didang decoction（P0

4、05 or P001）.Conclusion Upregulation on InR gene expression is possibly one of the mechanisms of modified Didang decoction in treating insulin resistance.Key words： Didang decoction; insulin resistance; insulin receptor; gene expression   胰島素抵抗（Insulin Resistance, IR）是胰島素作用的靶器官、組織對胰島素的生物學(xué)效應(yīng)

5、反應(yīng)降低或喪失而產(chǎn)生的一系列病理和臨床表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過選用高脂高糖飼料復(fù)制IR大鼠模型，用加減抵當(dāng)湯進(jìn)行干預(yù)，并用西藥文迪雅進(jìn)行對照，觀察其相關(guān)指標(biāo)的變化，并從分子水平檢測胰島素受體基因在肝臟中表達(dá)的變化，為臨床防治IR并闡明其作用機(jī)理提供客觀依據(jù)。1  材料與方法11  實(shí)驗(yàn)動物及分組  健康雄性SD大鼠60只，體重：20880±729g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)及管理。60只雄性SD大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，再隨機(jī)分為6組，即正常組10只、模型組10只、加減抵當(dāng)湯治療大劑量組10只、中劑量組10只、小劑量組10

6、只、文迪雅對照組10只。正常組給予常規(guī)飼料，模型組和中藥治療組給予高脂高糖飲食，各組分別自由飲水。12  飼料  基礎(chǔ)飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；高脂高糖飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院配制，其中基礎(chǔ)飼料50%、熟豬油10%、蔗糖25%、蛋黃粉15%。13  主要試劑及儀器  葡萄糖試劑盒，甘油三酯試劑盒，膽固醇試劑盒，高密度脂蛋白試劑盒，購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；低密度脂蛋白試劑盒，購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；胰島素放射免疫分析藥盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；RNA抽提試劑盒購自Promega公司；RTPCR試劑盒購自TAKARA公司；全自動

7、血液流變儀，LBY/Nb北京普利生集團(tuán)產(chǎn)品；低溫冰箱：BCD216E/B型，青島海爾電器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。PCR循環(huán)儀：T personal型， Biometra公司產(chǎn)品。14  藥物  加減抵當(dāng)湯組成：酒制大黃9g,桃仁9g,水蛭6g,黃芪20g；以上各藥購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，按比例稱取后，水煎后濃縮制成每毫升煎液含生藥3 g，高溫消毒滅菌，置于4冰箱保存?zhèn)溆?。文迪雅：購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，粉碎后溶于09%的生理鹽水。15  使用劑量  根據(jù)臨床用藥情況，折算成大鼠使用劑量。大、中、小劑量分別

8、是成人（60kg）日用藥量的20、10、5倍，并稀釋成相同的給藥容量。對照組文迪雅取成人（60kg）日用藥量的10倍，并稀釋成相同的給藥容量。16  處理方法  正常組給予常規(guī)飼料同時灌服等容量的生理鹽水，模型組和中藥組給予高脂高糖飲食，模型組同時灌服等容量的生理鹽水，中藥組同時灌服大、中、小劑量的加減抵當(dāng)湯中藥煎劑，西藥對照組給予文迪雅溶解液，共12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食12h，腹主靜脈取血并取肝組織用于各項(xiàng)檢測。17  指標(biāo)檢測  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空腹取血，用葡萄糖氧化酶法測葡萄糖（FBS）；放射免疫法測胰島素（FINS）；計算各自胰島素敏感指數(shù)ISI=ln

9、1/(FBS×FINS)；脂酶法測膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDLC）；全自動血流變儀測定全血比黏度（WBV）、血漿比黏度（PV）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)（RTPCR）檢測肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）、胰島素受體（InR）的基因表達(dá)。18  InRmRNA和PPARmRNA的表達(dá)  (1)組織RNA提?。阂勒誘rizol Reagent使用說明書進(jìn)行。(2) RTPCR：按RTPCR試劑盒中方法操作,設(shè)肌動蛋白基因（actin）為內(nèi)參基因。(3)引物及擴(kuò)增片段,InR引物:上游：5GCTGAGCAACCTT

10、ACCAA3下游：5AAATGTGTACGAACTATC 3   擴(kuò)增產(chǎn)物大小為602bp。PPAR引物上游：5CACAAGAGCTGACCCAATGGTTGCTG3下游：5CGCAGATCAGCAGACTCTGGGTTC3   擴(kuò)增產(chǎn)物大小為471bp。actin上游：5GTCACCAACTGGGACGAT3下游：5GAGGCATACAGGGACAACA3   擴(kuò)增產(chǎn)物大小為209bp。(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析：PCR產(chǎn)物電泳完畢后在凝膠掃描儀上觀察結(jié)果，用目的基因光密度值與actin光密度值的比值進(jìn)行半定量分析，得出結(jié)果。19&#

11、160; 統(tǒng)計學(xué)方法  本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 115統(tǒng)計軟件。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析對各組均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P005時有統(tǒng)計學(xué)意義。         2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果21  空腹血糖（FBS）、胰島素（FINS）和胰島素敏感指數(shù)（ISI）  模型組空腹血糖較正常組明顯升高（P001）；各藥物治療組與模型組相比，空腹血糖有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組與正常組相比，血清胰島素水平明顯升高（P001），胰島素敏感指數(shù)明顯

12、下降（P001），各中藥治療組與模型組相比，中劑量組血清胰島素下降、胰島素敏感指數(shù)上升最明顯（P001），高劑量組次之（P005），低劑量組療效不顯（P005）；文迪雅組與模型組相比，血清胰島素下降、胰島素敏感指數(shù)上升顯著（P001），與中藥中劑量組相比無顯著差異，見表1。表1  各組大鼠FBS、FINS及ISI情況比較(略)表示與正常組比較,*P001，表示與模型組比較,P005，表示與模型組比較,#P001)22  血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）和低密度脂蛋白（LDLC）  與正常組相比，模型組血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂

13、蛋白顯著升高（P001）。各中藥治療組與模型組相比，中劑量組血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白顯著降低（P001），高劑量組次之（P005），低劑量組和文迪雅組與模型組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義。各組高密度脂蛋白未見明顯差異，見表2。表2  各組大鼠血脂情況比較(略)表示與正常組比較,*P001，表示與模型組比較,P005，表示與模型組比較,#P00123  全血比黏度（WBV）和血漿比黏度（PV）  與正常組相比，模型組全血比黏度和血漿比黏度均升高（P001），各中藥治療組與模型組相比，中劑量組全血比黏度和血漿比黏度均降低明顯（P001），高劑量組也有降低（P005）

14、，低劑量組和文迪雅組與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。表3  各組大鼠血液流變學(xué)情況比較(略)表示與正常組比較,*P001，表示與模型組比較,P005，表示與模型組比較,#P00124  InRmRNA和PPARmRNA的表達(dá)  從肝臟的RTPCR結(jié)果可知，與正常組相比，模型組InRmRNA和PPARmRNA表達(dá)均明顯降低（P001），各中藥治療組與模型組相比，中劑量組InRmRNA的表達(dá)上升最顯著（P001），高劑量組次之（P005），低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義，而各中藥治療組PPARmRNA的表達(dá)無明顯變化。文迪雅組與模型組相比，InRmRNA的表達(dá)無明顯變化，而P

15、PARmRNA的表達(dá)有明顯升高（P001）。具體見圖1-2，表4。表4  各組大鼠肝臟InR和PPAR與actin光密度值比較表(略)表示與正常組比較,*P001，表示與模型組比較,P005，表示與模型組比較,#P001圖1  各組大鼠肝臟InRmRNA表達(dá)的比較(略)圖2  各組大鼠肝臟PPARmRNA表達(dá)的比較(略)   泳道1-6分別代表Mark、正常組、模型組、加減抵當(dāng)湯高劑量組、中劑量組、低劑量組、文迪雅組3  討論高脂高糖飲食致IR動物模型和人類肥胖時的IR病因?qū)W相似，由于這一模型具有復(fù)制時間短、飼養(yǎng)方便、可靠性高、價格較

16、低等特點(diǎn)1，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于IR機(jī)理和治療研究。高脂高糖飲食可以引起多種組織對胰島素敏感性的降低，主要表現(xiàn)為外周組織對胰島素刺激的葡萄糖處理能力下降及胰島素對肝臟葡萄糖輸出抑制能力降低2。對IR形成過程中的中醫(yī)證候研究表明，氣虛證貫穿IR形成的整個過程，而在IR的后期，以血瘀證等實(shí)證為主兼有氣虛，且實(shí)證的IR程度較虛證為著3。因此，本研究以益氣活血化瘀立法，通過經(jīng)方抵當(dāng)湯去虻蟲，加黃芪，組成益氣活血化瘀方，方中水蛭直入血絡(luò)，善能破血逐瘀；桃仁活血化瘀；大黃瀉熱導(dǎo)瘀；黃芪益氣補(bǔ)虛。四味組方，共成益氣活血化瘀之劑。對于胰島素抵抗機(jī)理的研究，目前認(rèn)為主要可分為受體前、受體水平和受體后抵抗。受體前水平，

17、主要指胰島素基因突變引起的胰島素一級結(jié)構(gòu)的改變和胰島素生物活性降低，或胰島素自身抗體的產(chǎn)生阻斷胰島素的生物活性；受體水平，主要指胰島素受體基因突變造成的胰島素受體生物合成減少；胰島素受體向細(xì)胞內(nèi)表面轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；胰島素受體降解加速等，均可致細(xì)胞表面胰島素受體數(shù)目減少。本實(shí)驗(yàn)選擇在受體水平研究中藥對IR的影響，通過其基因表達(dá)的變化來探討中藥改善IR的作用機(jī)理。馬來酸羅格列酮（商品名文迪雅）屬噻唑烷二酮類抗糖尿病藥，是PPAR的高選擇性、強(qiáng)效激動劑，是目前臨床上常用的胰島素增敏劑，它通過降低胰島素抵抗，提高胰島素的敏感性而有效地控制血糖。因此，本實(shí)驗(yàn)用文迪雅作為陽性對照藥，以比較中藥加減抵當(dāng)湯的療效及

18、作用機(jī)理。通過實(shí)驗(yàn)可知，加減抵當(dāng)湯可有效地改善IR，其中中劑量組的療效與文迪雅相當(dāng)，同時，該方能降低血脂，降低血液黏稠度，而文迪雅則不具有該項(xiàng)功能。從RTPCR的結(jié)果來看，加減抵當(dāng)湯方能有效地上調(diào)InRmRNA的表達(dá)，而文迪雅則有效地上調(diào)PPARmRNA的表達(dá)，但對InRmRNA的表達(dá)無影響。可見，中藥加減抵當(dāng)湯方改善IR的機(jī)理與文迪雅不同，上調(diào)InRmRNA的表達(dá)可能是加減抵當(dāng)湯改善IR的機(jī)理之一。在中藥不同劑量的療效中，以加減抵當(dāng)湯中劑量最佳。高劑量時，可能由于藥物濃度太高，藥液黏稠，影響機(jī)體的吸收功能從而影響藥效；低劑量時，可能藥物濃度過低，致藥效不顯?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Storlien LH, Higgins JA, Thomas TC, et al. Diet composition and insulin action in animal modelsJ. Br J Nutr, 2000,