黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯的敏感性

1、9期 王 巖等：黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯的敏感性1817黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯的敏感性王 巖1，馮明鳴1，劉西莉1，司乃國2（1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100094；2 沈陽化工研究院 ，沈陽 110021）摘要：【目的】研究黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯的敏感性，明確建立敏感性基線的生物測定方法。【方法】本研究以專性寄生菌黃瓜霜霉病菌為靶標(biāo)菌，采用凹玻片法和葉碟保濕法，測定了該病原菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯的敏感性?！窘Y(jié)果】研究結(jié)果表明，烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌休止孢的萌發(fā)沒有影響，對黃瓜霜霉病菌游動孢子釋放、游動孢子游動、芽管伸長、菌絲擴(kuò)展、孢囊梗形成及孢

2、子囊產(chǎn)生均有抑制作用，而且對黃瓜霜霉病菌的游動孢子釋放、游動孢子游動和芽管伸長有顯著的抑制作用。其中對黃瓜霜霉病菌的游動孢子釋放和芽管伸長EC50值分別為0.0250和0.0037 g·ml-1；并且當(dāng)烯肟菌酯濃度為0.05 µg·ml-1時能使游動孢子消解，抑制休止孢的形成；當(dāng)藥劑濃度為5 g·ml-1時，對病斑的擴(kuò)展和孢子囊產(chǎn)生抑制率分別達(dá)到60.41%和92.10%，且對孢囊梗的產(chǎn)生也有顯著的抑制作用?！窘Y(jié)論】綜合考慮試驗方法的可操作性和穩(wěn)定、準(zhǔn)確性，推薦使用葉碟保濕法測定烯肟菌酯對菌絲擴(kuò)展的EC50，用以建立敏感基線并進(jìn)行田間抗藥性監(jiān)測。關(guān)鍵詞：

3、烯肟菌酯；黃瓜霜霉病菌；發(fā)育階段；敏感性Sensitivity of Pseudoperonospora cubensis at Different Development Stages to EnostrobilurinWANG Yan1, FENG Ming-ming1, LIU Xi-li1，SI Nai-guo2(1College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094; 2 Shenyang Research Institute of Chemical Industry,

4、 Shenyang 110021) Abstract: 【Objective】 The bioassay method of baseline sensitivity was developed on the basis of the effect of enostrobilurin on Pseudoperonospora cubensis at different development stages during its life cycle. 【Method】 The sensitivity was determined by concave-slide and the leaf di

5、scs assay in vitro respectively. 【Result】The results showed that enostrobilurin did not show any effect on cystospore germination, but prevented the zoospore release, zoospore motility, germ tube elongation, hyphal growth, sporangiophore emergence from stomata and zoosporangial formation. The EC50 v

6、alues of enostrobilurin to zoospore release and germ tube elongation were 0.0250 g·ml-1, 0.0037 g·ml-1 respectively. Enostrobilurin resulted in zoospore breakdown at 0.05 g·ml-1 and inhibited obviously hyphal growth, sporangiophore emergence from stomata and sporangial formation at 5

7、g·ml-1.【Conclusion】 These studies suggested that leaf discs assay in vitro was an accurate and reliable method to determine the EC50 values of flumorph to P.cubensis, the baseline sensitivity and the resistance strain in field. Key words: Enostrobilurin; Pseudoperonospora cubensis; Different de

8、velopment stages; Sensitivity0 引言【本研究的重要意義】通過研究烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段的影響，明確建立敏感性基線的生物測定方法，并為進(jìn)一步系統(tǒng)研究黃瓜霜霉病菌對烯肟菌酯抗藥性機(jī)制提供參考，為明確藥劑的最佳使用時期及指導(dǎo)田間科學(xué)施藥提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甲氧丙烯酸酯類殺菌劑是20世紀(jì)90年代初開發(fā)的一類新型殺菌劑，其殺菌譜廣，能同時有效地防治多種病原真菌和卵菌引起的病害，對環(huán)境和非靶標(biāo)生物安全、友好，并且具有全新的作用機(jī)制，與目前使用的DMIs、苯酰胺類、二甲酰亞胺類和苯并咪唑類殺菌劑無交互抗性，從而引起了全世界的關(guān)注，并得到廣泛應(yīng)用16。這是繼

9、苯并咪唑類和三唑類殺菌劑后，再次震撼殺菌劑領(lǐng)域的一類具有廣泛影響的新穎殺菌劑。本試驗研究藥劑烯肟菌酯（enostrobilurin），商品名為佳斯奇，是由沈陽化工研究院1997年開發(fā)的國內(nèi)第一個甲氧丙烯酸酯類殺菌劑。該藥劑殺菌譜廣、活性高，具有預(yù)防及治療作用。目前已申請了中國（CN1191670）、美國、日本及歐洲專利，2002年完成農(nóng)藥臨時登記，登記靶標(biāo)對象為黃瓜霜霉病菌 79。【本試驗的切入點】目前未見有關(guān)該藥劑對病原菌不同抑制階段和作用機(jī)制的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗以目前生產(chǎn)上使用的嘧菌酯（商品名Amistar）為對照藥劑10,11，研究黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯和對

10、照藥劑的敏感性，用以建立敏感基線，并進(jìn)行田間抗藥性監(jiān)測的生物測定方法。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 供試黃瓜品種 精選長春密刺，市售。1.1.2 供試菌株 黃瓜霜霉病菌，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理藥理研究室自田間未施用過甲氧基病烯酸酯類殺菌劑的黃瓜栽培地采集分離。1.1.3 供試藥劑 98%烯肟菌酯（enostrobilurin）和95.6%嘧菌酯（azoxystrobin），分別由沈陽化工研究院和先正達(dá)農(nóng)化有限公司提供。1.1.4 試劑和儀器 0.001% Calcofluor White M2R（pH 8.0）染色劑（簡稱CWMR），購于Sigma公司； Olympus BX60多

11、功能顯微鏡（WU激發(fā)，波長365 nm）。1.2 試驗方法1.2.1 黃瓜霜霉病菌的采集、分離和保存 從北京郊區(qū)未施用過甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的黃瓜栽培地采集黃瓜霜霉病葉，用無菌水清洗病葉上的雜質(zhì)和老的孢子囊，然后保濕于培養(yǎng)皿中，置于19、RH>80%、光暗交替條件下培養(yǎng)，待葉片上產(chǎn)生大量新的孢子囊后， 用無菌水洗脫單病斑上產(chǎn)生的新孢子囊，轉(zhuǎn)接到已采集的健康離體葉片上，于19、RH>80%、12 h光暗交替的生長間培養(yǎng)，備用。1.2.2 孢子囊懸浮液的配制 用4無菌水洗脫經(jīng)1.2.1處理后在離體葉片上擴(kuò)繁產(chǎn)生的孢子囊，配制成濃度為每毫升含1×105個孢子囊的懸浮液。1.2

12、.3 系列濃度藥劑的配制 98%烯肟菌酯、95.6%嘧菌酯分別以丙酮、甲醇為溶劑，配制成1×104µg·ml-1溶液作為母液，放置于4冰箱中備用。試驗時將母液用無菌水分別配制成系列濃度藥液（稀釋液中甲醇的含量控制在體積分?jǐn)?shù)為0.1%以下），以含有相同濃度甲醇的蒸餾水為空白對照，進(jìn)行葉片處理時藥液中加入體積分?jǐn)?shù)為0.005%的Tween-20，以增加藥液在葉片上的展著和滲透。1.2.4 殺菌劑對黃瓜霜霉病菌游動孢子釋放的影響 將配制好的黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液和系列濃度藥劑各20 µl同時滴加到凹玻片上，在19黑暗的生長間保濕培養(yǎng)，3 h后待對照中80%

13、以上的孢子囊釋放出游動孢子，在顯微鏡下觀察并計算100個孢子囊的空囊率，每個濃度重復(fù)4次12。1.2.5 殺菌劑對黃瓜霜霉病菌游動孢子游動、游動孢子萌發(fā)及芽管伸長的影響 將配制好的黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液20 µl滴加于凹玻片上，置于19、RH>80%黑暗生長間中培養(yǎng)。（1）3 h后待對照中多于80%的孢子囊釋放，分別加入系列濃度的藥劑20 µl。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，顯微鏡下觀察（×100），并記錄100個孢子的游動孢子個數(shù)。（2）4 h后待大于80%的游動孢子形成休止孢，再滴加系列濃度的藥劑繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用顯微鏡觀察休止孢萌發(fā)的情況并記錄100個休止孢的

14、萌發(fā)率13。（3）施藥5 h后，待對照的休止孢萌發(fā)率達(dá)到50%以上，CWMR染色，通過顯微鏡觀察照相，并用Image-Proplus Version 5.0軟件測量芽管長度。1.2.6 殺菌劑對黃瓜霜霉病菌菌絲擴(kuò)展、孢囊梗和孢子囊形成的影響 采用葉碟保濕培養(yǎng)法，將10 µl孢子囊懸浮液接種在黃瓜葉盤背面（直徑為1.5 cm），于19黑暗的生長間保濕培養(yǎng)48 h，測量并記錄病斑面積，然后將葉盤在系列濃度的藥劑中浸泡10 min，繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每個濃度重復(fù)50個葉盤，待對照葉盤產(chǎn)生黑色霉層，病斑擴(kuò)展比較明顯的時進(jìn)行如下處理：（1）再次測量病斑面積，計算不同藥劑系列濃度處理后病斑擴(kuò)展率

15、；（2）在葉盤上直接滴加CWMR染色14，并在熒光顯微鏡下（×200）觀察孢囊梗的形成情況，記錄每視野內(nèi)孢囊梗的數(shù)目；（3）計算單位病斑面積上的產(chǎn)孢量。2 結(jié)果與分析2.1 殺菌劑對黃瓜霜霉病菌游動孢子釋放和游動孢子游動的影響研究結(jié)果如表1、圖1所示，烯肟菌酯和對照藥劑嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌游動孢子的釋放和游動孢子的游動均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中對游動孢子釋放的EC50值分別為0.0250 g·ml-1（y = 3.0041x + 9.8144，R2 = 0.9231）和0.0097 g·ml-1（y = 5.5431x + 16.155，R2 = 0.963）；

16、且當(dāng)嘧菌酯濃度為0.05 µg·ml-1時能完全抑制游動孢子的游動，嘧菌酯濃度為0.1 µg·ml-1、烯肟菌酯濃度為0.05 µg·ml-1時能使游動孢子消解，抑制了休止孢的形成。2.2 殺菌劑對黃瓜霜霉病菌休止孢萌發(fā)和芽管伸長的影響研究結(jié)果如表2、圖2所示，烯肟菌酯和對照藥劑嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌休止孢萌發(fā)沒有抑制作用，但當(dāng)藥劑濃度為5 µg·ml-1時，兩種藥劑都能使休止孢表1 藥劑對黃瓜霜霉病菌游動孢子釋放和游動孢子游動的影響Table 1 Effect of fungicides on zoospore r

17、eleased from zoosporangia and zoospore motility of P. cubensis藥劑濃度Concentration（g·ml-1）游動孢子釋放率（%）/抑制率（%）Percentage of released zoosporangia（%）/ Rate of inhibition（%）游動孢子游動率（%）/抑制率（%）Percentage of zoospore（%）/ Rate of inhibition（%）烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobi

18、n0.00094.25A92.00A83.33A83.33A0.00589.75B/4.7488.25B/4.0867.00B/19.6050.00B/40.000.00786.75C/7.9678.00C/15.2261.00C/26.8022.00C/73.600.01082.50D/12.4724.75D/73.1058.00D/30.4010.00D/88.000.05013.5F/85.680.00F/100.00+0.00E/100.000.1001.75G/98.140.00F/100.00+0.500-+數(shù)據(jù)后不同的大寫字母代表處理間的顯著差異(P=0.01)，以下各表相同。+

19、：游動孢子消解；-：未試驗Number followed by same letters are data significantly different at P=0.01 level according to Duncans multiple range test. The same as in the following tables. +: Zoospore breakdown; -: No dataDABCEFS ZCESZA、B、C、D、E、F代表0.000，0.007，0.010，0.030，0.050 g·ml-1濃度藥劑對黃瓜霜霉病菌的游動孢子釋放和游動孢子游動的影

20、響；S游動孢子未釋放的孢子囊，ES游動孢子釋放后的空孢子囊，Z游動孢子, ZC游動孢子消解A, B, C, D, E, F showed the effect of a concentration series of enostrobilurin on zoospore released from sporangia and zoospore motility at 0.000, 0.005, 0.007, 0.010, 0.030, 0.050 g·ml-1, respectively; SZoosporangia undischarging zoospore, ESEmpty z

21、oosporangia, ZZoospore, ZCZoospore breakdown圖1 烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌的游動孢子釋放和游動孢子游動影響Fig.1 Effect of fungicide on zoospore released from zoosporangia and zoospore motility of P. cubensis消解。烯肟菌酯和嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌芽管伸長均有顯著的抑制作用，EC50 值分別為0.0239 g·ml-1（y = 2.8147x + 9.5618，R2 = 0.9298）、0.0145（y = 0.5699x + 6.047，R2 =

22、 0.8051）。2.3 殺菌劑對黃瓜霜霉病菌菌絲擴(kuò)展、孢囊梗形成和孢子囊產(chǎn)生的影響試驗結(jié)果（表3、圖3）表明，隨著處理藥劑濃度的提高，烯肟菌酯和嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌病斑擴(kuò)展的抑制作用加強(qiáng)，當(dāng)藥劑濃度為5 g·ml-1時，兩種藥劑對病斑擴(kuò)展的抑制率分別為60.41%和83.05%，表明這兩種藥劑對病原菌菌絲在細(xì)胞間隙的擴(kuò)展均有一定的抑制作用。試驗中也觀察到（圖2）藥劑對黃瓜霜霉病菌孢囊梗的形成具有一定的影響作用，當(dāng)藥劑濃度高于0.5 g·ml-1時，隨著藥劑濃度的增加，黃瓜霜霉病菌孢囊梗的產(chǎn)生數(shù)量逐漸減少。當(dāng)烯肟菌酯和嘧菌酯濃度為5g·ml-1時，顯著地影響了孢囊

23、梗的形成，且兩種藥劑對黃瓜霜霉病菌孢子囊產(chǎn)生的抑制作用也分別達(dá)到92.10%和100%。表2 藥劑對黃瓜霜霉病菌休止孢萌發(fā)和芽管伸長的影響Table 2 Effect of fungicides on cystospore germination and length of germ tube of P. cubensis藥劑濃度Concentration（g·ml-1）休止孢萌發(fā)率(%)/抑制率(%)Percentage of germinated cystospore(%) /Rate of inhibition (%)芽管長度(m)/抑制率(%)Length of germ t

24、ube(m) /Rate of inhibitionp(%)烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin0.00060.33A60.33A79.29A79.29A0.00569.33A/-14.9161.00A/-1.1141.93B/47.1255.29B/30.260.01060.33A/0.0071.00A/-17.6825.41C/67.9538.43C/51.530.05056.75A/5.9456.50A/6.3517.44C78.0022.08D/72.150.50059.00A/2.2159

25、.25A/1.7916.03C79.7818.82D/76.265.000+10.000+：休止孢消解 Cystospore breakdownDABCEFA、B、C、D、E、F分別代表0.000，0.007，0.010，0.030，0.050 g·ml-1濃度藥劑對黃瓜霜霉病菌的休止孢萌發(fā)和芽管伸長的影響A, B, C, D, E, F showed the inhibition of a concentration series of enostrobilurin on cystospore germination and elongation of germ tube at 0

26、.000, 0.005, 0.007, 0.010, 0.030, 0.050 g·ml-1, respectivelyABBED圖2 烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌的休止孢萌發(fā)和芽管伸長的影響Fig. 2 The effect of cystospore germination and enostrobilurin on elongation of germ tube of P. cubensis表3 藥劑對黃瓜霜霉病菌病斑擴(kuò)展和孢子囊形成的影響Table3 Effect of fungicides on the extension of lesion and sporulation of

27、 P. cubensis 藥劑濃度Concentration(g·ml-1)病斑面積(mm2)/抑制率(%)Lesion area (mm2)/ Rate of inhibition(%)單位面積孢子囊形成數(shù)目(mm2)/抑制率(%)Number of zoosporangia per mm2 (mm2) / Rate of inhibition(%)烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin0.00095.92A196.25A1470.27B1747.83A0.005100.59A/-4.87

28、178.75A /8.922017.39C/-37.211538.23C /11.990.01089.25A/6.95193.40A /1.451803.33A/ -22.651631.58B / 6.650.05083.71A/12.72184.00A /6.241350.33D/8.141368.16D / 13.550.50039.82B/58.48160.00B /18.47365.00E/75.171396.86 E / 20.085.00037.97B/60.4133.26C /83.05116.13F/92.100.00f / 100.0010.00013.00C /93.380

29、.00f / 100.00：未試驗 No dataDABCEFA、B、C、D、E、F分別代表0.000、0.005、0.05、0.1、0.5、1 g·ml-1濃度藥劑對黃瓜霜霉病菌的孢囊梗形成的影響A, B, C, D, E, F showed the effect of a concentration series of enostrobilurin on the emergence of sporangiophore at 0.000, 0.005, 0.05, 0.1, 0.5, 1 g·ml-1, respectively圖3 烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌孢囊梗形成的影響

30、Fig.3 The effect of enostrobilurin on the emergence of sporangiophore of P. cubensis3 討論3.1 嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌發(fā)育階段的影響與朱書生等14報道的一致。烯肟菌酯和嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段的作用效果相似，對黃瓜霜霉病菌的休止孢萌發(fā)階段沒有抑制作用，對黃瓜霜霉病菌的孢子囊釋放、游動孢子游動和芽管伸長有顯著的抑制作用，由此推測烯肟菌酯和嘧菌酯可能具有相同的作用機(jī)制及存在著交互抗藥性，建議烯肟菌酯不可與目前市場上廣泛推廣使用的嘧菌酯交替和重復(fù)使用。目前有關(guān)烯肟菌酯作用機(jī)制和抗藥性機(jī)制目前還未見具體報道。

31、已有研究表明，嘧菌酯主要作用于真菌的線粒體，藥劑與線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合物（Cytbc1復(fù)合物）結(jié)合，阻斷電子從Cytbc1復(fù)合物流向Cytc，破壞能量合成從而抑制真菌生長或殺死真菌1519。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討烯肟菌酯作用機(jī)制和抗藥性機(jī)制提供了參考。3.2 已有研究報道表明，嘧菌酯對大多數(shù)植物病原真菌和卵菌有很強(qiáng)的抑菌活性，既能抑制菌絲生長又能抑制孢子萌發(fā)，但對于病菌不同發(fā)育階段作用效果不同，對大多病菌的孢子萌發(fā)抑制作用優(yōu)于菌絲生 長6, 20。本試驗研究結(jié)果表明，黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對藥劑表現(xiàn)出不同程度的敏感性，其中在供試濃度下對休止孢的萌發(fā)沒有影響，對菌絲擴(kuò)展有明顯的抑制作用。因此

32、，在相關(guān)的生物測定試驗中，不宜采用常規(guī)的孢子萌發(fā)抑制法測定烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌的抑菌作用?；谒巹z生長的抑制作用，并綜合考慮試驗方法的可操作性和穩(wěn)定、準(zhǔn)確性，推薦使用葉碟保濕法測定烯肟菌酯對菌絲擴(kuò)展的EC50，用以建立敏感基線并進(jìn)行田間抗藥性監(jiān)測。4 結(jié)論4.1 黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對烯肟菌酯的敏感性研究結(jié)果表明，烯肟菌酯和嘧菌酯對黃瓜霜霉病菌的休止孢萌發(fā)階段沒有抑制作用，對黃瓜霜霉病菌的游動孢子釋放、游動孢子游動、芽管伸長、菌絲擴(kuò)展、孢子囊梗形成、孢子囊產(chǎn)生各階段均有抑制作用，而且兩個供試藥劑對黃瓜霜霉病菌游動孢子釋放、游動孢子游動和芽管伸長有顯著的抑制作用。4.2 研究表明，葉

33、碟保濕法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度高，可操作性強(qiáng)。推薦使用該方法測定烯肟菌酯對菌絲擴(kuò)展的EC50，并用以建立敏感基線及進(jìn)行田間抗藥性監(jiān)測。4.3 烯肟菌酯對黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段的影響不同，表明烯肟菌酯兼有保護(hù)和治療的雙重作用，因此生產(chǎn)中可作為保護(hù)和治療劑使用。并且應(yīng)避免烯肟菌酯與目前市場上廣泛推廣使用的嘧菌酯或同類其它殺菌劑交替和重復(fù)使用。References1 張舒亞, 周明國. 甲氧丙烯酸酯類殺菌劑的生物學(xué)及應(yīng)用技術(shù)研究. 見：中國植物病害化學(xué)防治研究（第三卷），北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002：1-10.Zhang S Y, Zhou M G. Research on biology an

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