微生物限度檢測

1、微生物限度檢查法錄入時間：2006-7-6 15:25:25 來源：其它微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個以上最小包裝單位）的 3倍量。檢查的全過程，均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為3035C，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2528C，控制菌培養(yǎng)溫度為 36C± 1C。檢驗(yàn)結(jié)果的報告以1g、1ml或10cm2為單位。培養(yǎng)基及其制備方法除另有規(guī)定外，培養(yǎng)基制備的滅菌條件為121C20分鐘。1. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基見無菌檢查法（附

2、錄幻 H。2. 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基胨 5g玫瑰紅鈉0.0133g 葡萄糖 10g瓊脂 15 20g 磷酸二氫鉀1g 水 1000ml硫酸鎂 0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，加熱溶化后，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。3. 酵母浸岀粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （YPD）胨10g 瓊脂 1520g酵母浸出粉5g水 1000ml葡萄糖 20g除葡萄糖外，取上述成分，混合，加熱溶化后，濾過，加入葡萄糖，分裝，滅菌。4. 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）胨 20g磷酸二氫鉀1.3g 乳糖5g牛膽鹽（或去氧膽酸鈉 0.5g ） 2g氯化鈉 6g水 1000ml磷酸氫二鉀 4.0g除乳糖、牛膽鹽外，

3、取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ±0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，滅菌。5. 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 (EMB)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100ml曙紅鈉指示液 2ml20乳糖溶液5ml亞甲藍(lán)指示液 1.31.6ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60C，按無菌操作加入滅菌的其他3 種溶液，搖勻，傾注平皿。6. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 (MacC)胨 20g 1%中性紅指示液3ml乳糖 10g 瓊脂 1520g牛膽鹽 5g 水 1000ml氯化鈉 5g除乳糖、指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ±0.2，加

4、入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60C，傾注平皿。7.4-甲基傘形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl- B -D-Glucuronide ， MUG培養(yǎng)基胨 10g 磷酸二氫鉀 0.9g 硫酸銨 5g磷酸氫二鈉 ( 無水 )6.2g酸錳 0.5mg亞硫酸鈉 40mg硫酸鋅 0.5mg去氧膽酸鈉 1g硫酸鎂 0.1gMUG 75mg氯化鈉 11g水 1000ml氯化鈣 50mg7.3 ±0.1 ,加入MUG溶解后，每管分裝5ml,除MUG外，各成分溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為115C滅菌20分鐘。8. 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 (

5、TSI)胨 20g 硫酸亞鐵 0.2g 牛肉浸出粉 5g硫代硫酸鈉 0.2g 乳糖 10g 硫代硫酸鈉 12.5ml蔗糖 10g 瓊脂 1215g 葡萄糖1g枸櫞酸鐵銨 1g枸櫞酸鐵銨 1g水 1000ml 氯化鈉 5g除三糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3 ±0.1，加入瓊脂,加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層(23cm)短斜面。枸櫞酸鐵銨 1g枸櫞酸鐵銨 1g9. 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 (TTB)胨 5g 硫代硫酸鈉 30g 牛膽鹽1g枸櫞酸鐵銨 1g枸櫞酸鐵銨 1g水 1000ml 硫酸鈣 10g5g,溶于20m

6、l水中)0.2ml和亮綠試液0.1ml，取上述成分，混合，微溫使溶解，滅菌。臨用前，取上述培養(yǎng)基， 每 10ml 加入碘溶液 ( 取碘 6g 與碘化鉀 混勻。10. 沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基 (SS)胨 5g 硫代硫酸鈉 8.5g 牛肉浸出粉 5g中性紅指示液 2.5ml乳糖 10g亮綠試液 0.33ml牛膽鹽 8.5g瓊脂 20g枸櫞酸鈉 8.5g水 1000ml枸櫞酸鐵銨 1g除乳糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ±0.1，濾過，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60C,傾注平皿。11. 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基 (DH

7、L)胨 20g 枸櫞酸鈉 1g 牛肉浸出粉 3g枸櫞酸鐵銨 1g 乳糖 10g 中性紅指示液 3ml蔗糖 10g 瓊脂 1820g去氧膽酸鈉1g水 1000ml 硫代硫酸鈉 2.3g除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ±0.1，加入瓊脂,加熱溶化后，再加入其余成分，搖勻，冷至60C，傾注平皿。12. 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基胨 10g溴化十六烷基三甲銨 0.3g牛肉浸出粉 3g瓊脂 1520g氯化鈉 5g水 1000ml除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.5 ±0.1，加入瓊脂，加熱溶化后,分裝，滅

8、菌，冷至60C，傾注平皿。13. 亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基臨用前，取滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每 100ml 中加入新配制的 1%亞碲酸鈉 (鉀)試液 0.2ml ，混勻，即得。14. 卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基胨 6g10%氯化鈉卵黃液100ml牛肉浸出粉 1.8g瓊脂 23g氯化鈉 30g水 650ml除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.6 ±0.1，滅菌，待冷至約60C，以無菌操作加入 10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋 1 個，以無菌操作取出卵黃，放入10%滅菌氯化鈉溶液 100ml 中，充分振搖，即得。15.

9、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基胨 10g酚磺酞指示液 2.5ml牛肉浸出粉 1g瓊脂 1520g甘露醇 10g水 1000ml氯化鈉 75g除甘露醇、指示液及瓊脂外，取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至60C，傾注平皿。16. 蛋白胨水培養(yǎng)基胰蛋白胨 10g水 1000ml氯化鈉 5g 取上述成分，混合，加熱溶化，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.3±0.1 ，分裝于小試管，滅菌。17. 磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基胨 7g磷酸氫二鉀 3.8g葡萄糖 5g水 1000ml取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后

10、為7.3 ±0.1，分裝于小試管，121C，滅菌 15分鐘。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉 5g枸櫞酸鈉 （無水 ） 2g硫酸鎂 0.2g溴麝香草酚藍(lán)指示液 20ml磷酸氫二鉀 1.0g瓊脂 1520g磷酸二氫銨 1g水 1000ml除指示液和瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.9 ±0.1，加入瓊脂，加熱溶化，加入指示液，混勻，分裝于小試管，滅菌，置成斜面。注：所用瓊脂應(yīng)不含游離糖，用前用水浸泡沖洗。18. 糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)液 胨 10g0.5%酸性品紅指示液10ml糖、醇 0.5%（ 或溴麝香草酚藍(lán)指示液 6ml）氯化鈉 5g水 1000ml取胨和氯

11、化鈉加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4，加入指示液，混勻，分裝每瓶100ml，121C滅菌15分鐘。配制葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基時，于100ml基礎(chǔ)液加入0.5g葡萄糖，分裝于含杜氏管（Durham）的小試管中，121C 滅菌15分鐘。配制其他糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基時，將各種糖、醇分別配成10%溶液，與基礎(chǔ)液同時于 121C滅菌15分鐘。以無菌操作將 5ml糖、醇溶液加入100ml基礎(chǔ)液內(nèi)，分裝于滅菌小試管中。注：糖、醇溶液亦可采用薄膜過濾法除菌。19. 脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基胨 1g0.2%酚磺酞指示液 6ml葡萄糖 1g20%無菌脲溶液100ml氯化鈉 5g瓊脂 20g磷酸二氫鉀 2g水 1

12、000ml除脲和瓊脂外，取上述成分，混合，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ±0.1，加入瓊脂，加熱溶化并分裝于錐形瓶，滅菌，冷至5055C，加入無菌脲溶液，混勻，分裝于滅菌試管中，置成斜面。20. 氰化鉀培養(yǎng)基胨 3g磷酸氫二鈉5.64g氯化鈉 5g氰化鉀試液15ml碳酸二氫鉀0.225g水 1000ml除氰化鉀試液外，取上述成分，混合，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.5 ±0.1，滅菌，冷卻后，加入氰化鉀試液，分裝于12mrW 100mm滅菌試管內(nèi)，每管4ml，立即用滅菌橡膠塞塞緊，置4C保存。同時，以不加氰化鉀試液的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，分裝于滅菌試管中。21. 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培

13、養(yǎng)基胨 5g1.6%溴甲酚紫指示液1ml酵母浸出粉 3gL-賴氨酸（DL-賴氨酸）0.5（1）g葡萄糖 1g水 1000ml除賴氨酸外，取上述成分，混合，加熱溶解后，加入L-賴氨酸（DL-賴氨酸），調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.8，同時以不加賴氨酸培養(yǎng)基作為對照。 分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管2.5ml并滴加一層液體石蠟，121C滅菌10 分鐘。22. 綠膿菌素 （pyocyanin） 測定用培養(yǎng)基 （PDP 瓊脂）胨 20g甘油 10ml氯化鎂 （ 無水 ） 1.4g瓊脂 1820g硫酸鉀 10g水 1000ml取胨、氯化鎂和硫酸鉀加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.3±0

14、.1 ，加入甘油及瓊脂，加熱 溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜面。23. 明膠培養(yǎng)基胨 5g明膠 120g牛肉浸出粉 3g水 1000ml取上述成分加入水中，浸泡約 20 分鐘，隨時攪拌，加熱使溶解，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.3±0.1 ，分裝于 小試管，滅菌。24. 硝酸鹽胨水培養(yǎng)基胨 10g亞硝酸鈉 0.5g酵母浸出粉 3g水 1000ml硝酸鉀 2g取胨和酵母浸出粉加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為 7.3±0.1 ，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解，混勻，分裝于含杜氏管的小試管，滅菌。試藥牛肉浸出粉 Beef extract powder 本品為米色粉末，

15、在水中溶解。牛膽鹽 Ox bile salt本品為淡黃色或黃棕色粉末，味苦而甜，具吸濕性，在水和醇中易溶。玫瑰紅鈉（四氯四碘熒光素鈉）Rose bengal C20H2CI4Na2O5=1017.6本品為棕紅色粉末。 在水中溶解, 溶液呈紫色，無熒光；在硫酸中溶解，溶液為棕色。枸櫞酸鐵銨 Ammonium ferric citrateC12H22FeN3O14=488.16本品為棕紅色或綠色鱗片或粉末,易潮解,見光易還原成亞鐵。在水中溶解,在醇和醚中不溶。胰蛋白胨 Tryptone本品為米黃色粉末,在水中溶解。液狀石蠟 Paraffin liquid 本品為無色油狀液體。在水和醇中不溶,能與醚

16、、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油類相混溶。DL-賴氨酸 DL-Lysine C6H14N2O2=146.19本品為白色結(jié)晶,極易潮解。在水中溶解。L-賴氨酸 L-Lysine C6H14N2O2=146.19 本品為白色針狀結(jié)晶,在空氣中易吸收二氧化碳。在水中易溶,在醇中微溶,在醚中不溶。酸性品紅 Fuchsin acid C20H17N3Na2O9S3=585.54 本品為綠色有金屬光澤的顆?；蛏罴t色粉末。在水中溶解,在醇中不溶。磷酸二氫銨 Ammonium dihydrogen phosphate NH4H2PO4=115.03 本品為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末。在水中溶解,在乙醇中不溶。試液二

17、鹽酸二甲基對苯二胺試液取二鹽酸二甲基對苯二胺 0.1g，加水10ml，即得。需新鮮少量配制，于冷處避光保存,如試液變成紅褐色,不可使用。無菌對氨基苯甲酸試液取對氨基苯甲酸0.1g,加入含10ml水的帶塞試管中，121C滅菌20分鐘。亞碲酸鈉（鉀）試液 取亞碲酸鈉（鉀）0.1g，加新鮮煮沸后冷至 50C的水10ml使溶解。玫瑰紅鈉試液取玫瑰紅鈉試液0.1g，加水使溶解成75ml。無菌枸櫞酸鈉-氯化鈉試液取枸櫞酸鈉0.5g，加0.9%氯化鈉溶液10ml，121C滅菌20分鐘。草酸銨試液取草酸銨1g，加水溶解使成100ml。亮綠試液取亮綠0.1g，加水100ml使溶解。氫氧化鉀試液取氫氧化鉀40g，

18、加水溶解使成100ml。鹽酸試液 取鹽酸 8.4ml ，加水稀釋成 100ml。a -萘酚乙醇試液取a -萘酚6.0g，加無水乙醇溶解使成 100ml。氰化鉀試液 取氰化鉀 0.5g ，加水溶解使成 100ml。氯化三苯四氮唑試液 取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成10ml。靛基質(zhì)試液 取對二甲氨基苯甲醛 5.0g ，加入戊醇 （或丁醇 ）75ml ，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸 25ml 徐徐滴入，邊加邊振搖， 以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深， 或取對二甲氨基苯甲醛 1.0g ，加入 95%乙醇 95ml， 充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸 20ml 徐徐滴入。稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶

19、液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml, 121C滅菌20分鐘。無菌聚山梨酯80-氯化鈉溶液取1ml聚山梨酯80,加0.9%氯化鈉溶液使成100ml, 121C滅菌20分鐘。無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml, 121C滅菌20分鐘。指示液中性紅指示液 取中性紅 1.0g ，研細(xì)，加 95乙醇 60ml 使溶解，再加水至 100ml。變色范圍 pH6.88.0 （紅-黃）。甲基紅指示液 取甲基紅0.1g，力口 95%L醇300ml，使溶解后，加水至 500ml，即得。亞甲藍(lán)指示液 取亞甲藍(lán) 0.5g ，加水溶解使成 100ml

20、。酚磺酞指示液 取亞甲藍(lán) 0.5g ，加 1mol/L 氫氧化鈉溶液 2.82ml ，使溶解，再加水至 100ml。變色范圍 pH6.88.4 （黃-紅）。溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫 1.6g ，加 95乙醇溶解使成 100ml。變色范圍 pH5.26.8 （黃-紫）。溴麝香草酚藍(lán)指示液 取溴麝香草酚藍(lán) 0.4g ，加 1mol/L 氫氧化鈉溶液 0.64ml 使溶解，再加水至 100ml。 變色范圍 pH6.07.6 （黃-藍(lán)）。酸性品紅指示液 取酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴 均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第 2 滴，直至溶液呈草黃色；

21、于沸水內(nèi)保持 15分鐘，再靜置 2小時，濾過，即 得。變色范圍 pH6.07.4（黃-紅）。曙紅鈉指示液 取曙紅鈉 2.0g ，加水溶解使成 100ml。供試品的檢驗(yàn)量每批供試品檢驗(yàn)量一般為 10g或10ml?；瘜W(xué)膜劑為100cm2,貴重的或微量包裝的供試品檢驗(yàn)量可以酌減，但口服藥品不得少于3g,外用藥品不得少于 5g。供試品須取自 2 個以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑除須取自 2 個以上的包裝單位外，應(yīng)取自 4 丸(片)以上 樣品。供試液的制備按供試品的理化特性與生物學(xué)特性可采取適宜的方法制成供試液。1. 液體供試品 取供試品10ml，加入稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。油劑可加適量聚山梨

22、酯 80;氣 霧劑以適宜方法使拋射劑導(dǎo)出后， 加入適量稀釋劑，混勻，吸取相當(dāng)于10g或10ml供試品，再稀釋成100ml 作為供試液;合劑 (系指含王漿或蜂蜜者，下同 ) 與滴眼劑可用供試品作為供試液。2. 固體、半固體或黏稠液供試品稱取供試品10g,置0.9 %無菌氯化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其他適宜方法，混勻后，作為供試液。在制備過程中，必要時可加適量聚山梨酯 80,并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過45C。非水溶性供試品取供試品5g(5ml),加入含溶化的無菌司盤 80 5g、單硬脂酸甘油酯 3g、聚山梨酯80 10g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后， 慢慢加入45C左右的0.9%無菌氯化

23、鈉溶液約80ml，邊 加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液(1 : 20)。(2) 不溶于水的膜劑供試品取規(guī)定量，剪碎，加稀釋劑 100ml (必要時可增加稀釋劑)，浸泡，振搖，作為供試液。腸溶膠囊(片)供試品稱取供試品10g,置含無菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)100ml的錐形瓶內(nèi)，于45'C水浴中，保溫，振搖，使溶解，作為供試液。3. 含抑菌成分供試品 供試品如干擾控制菌檢驗(yàn)，按以下方法處理后，依法檢查。(1) 稀釋法 將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。(2) 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液， 離心(每分鐘 3000轉(zhuǎn))30 分鐘，棄去上清液， 留

24、底部集菌液約 2ml， 再稀釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心 (每分鐘 500轉(zhuǎn))5 分鐘，取全部上層液，再行集 菌處理。(3) 薄膜過濾法 取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑 100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約 50mm孔徑不大于0.45卩m±0.02卩m微孔濾膜的過濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50100ml，取出濾膜備檢。(4) 中和法 凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試 對照用菌液 控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對照試驗(yàn)。對照菌株為大腸桿菌 CMCC(B) 44 102、沙門菌 CMCC(B) 50

25、 094、銅綠假單胞 CMCC(B) 10 104及金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003 。取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)1820小時后，稀釋至1 : 106。對照菌的加入量為 50100個。檢查法1. 細(xì)菌、霉菌與酵母菌計數(shù)(1) 平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成 1 ： 102、1 ： 103等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液各1ml,置直徑約90mm勺平皿中，再注入約 45'C的培養(yǎng)基約15ml，混 勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應(yīng)作23個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計

26、數(shù)。在特殊情況下，前者同時點(diǎn)計霉菌、 酵母菌菌落數(shù)，后者同時點(diǎn)計細(xì)菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。合劑用玫瑰 紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計數(shù)。液體制劑用 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時點(diǎn)計霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。菌數(shù)測定陰性對照試驗(yàn)取供試驗(yàn)用的稀釋劑各 1ml，置4個無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。細(xì)菌培養(yǎng)時間為 48 小時，分別在 24 小時及 48 小時點(diǎn)計菌落數(shù)，一般以 48 小時菌落數(shù)為準(zhǔn)，霉菌、酵母 培養(yǎng)時間為 72 小時，分別在 48 小時及 72 小時點(diǎn)計菌落數(shù)，一般以 7

27、2 小時菌落數(shù)為準(zhǔn)。菌落如蔓延生長 成片，不宜計數(shù)。點(diǎn)計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。菌數(shù)報告規(guī)則細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在 30300之間的稀釋級，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級作為報告菌數(shù)計算的依據(jù)。如有1個稀釋級在30300(30100)之間時，將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如同時有 2個稀釋級在30300(30100)之間時，按下式計算兩級比值。當(dāng)比值W2時，以兩稀釋級的均值報告，當(dāng)比值2時，以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如同時有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在 30300之間時，以后2個稀釋級計算級間比值報告；如各稀釋級的平 均菌落數(shù)均不在

28、30300之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平 均菌落數(shù)均在 300（100） 以上，按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，一般按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。如當(dāng)1 : 10（或1 : 100）稀釋級平均菌落數(shù)等于或大于原液（或1 : 10）稀釋級時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報告菌數(shù)。（2）培養(yǎng)基稀釋法取供試液（原液或1 ： 10、1 : 100供試液）3份，每份各1ml,分別注入5個平皿內(nèi)（每皿各0.2ml ）。每1個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約 15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml注入的5個

29、平板的菌落數(shù)之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1 時，則報告菌數(shù)為小于 10個。2.控制菌檢查 除另有規(guī)定外，取供試液 10ml （相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種，經(jīng) 增菌、分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭染色、生化試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn)等項(xiàng)檢查。（1） 大腸桿菌 （Escherichia coli） 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基 3 份，每份 100ml,2 份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌50100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時（必

30、要可延至 48小時） 。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述 3份的培養(yǎng)物各 0.2ml ，分別接種至 5ml MUG 培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時與24小時時，取未接種的 MU（培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置 365nm紫外 光下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG日性。供試液的 MUGt呈現(xiàn)熒光，MU（陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUGt內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。 當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無菌生長，判未檢出 大腸桿菌。供試液 MUG日性，靛基質(zhì)陽性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如MUG日性

31、、靛基質(zhì)陰性，或 MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞 甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌?；蛴芯渖L，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn) （V-P） 、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) （C） 及革蘭染色、鏡檢，按表 1 規(guī)定判斷結(jié)果。靛基質(zhì)試驗(yàn) （I） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24小時，沿管壁加入靛基質(zhì) 試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。甲基紅試驗(yàn) （M） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)

32、48 小時±2小時，于管內(nèi)加入甲基紅指示液數(shù)滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn) （V-P） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 48 小 時±2小時，于每2ml培養(yǎng)液中加入 a -萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振 搖，在 4 小時內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng)4872小時，培養(yǎng)基斜面有菌落生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮?。結(jié)果判斷見表1。對與MUG-I反應(yīng)不符的

33、可疑菌株（見注、），應(yīng)重新分離培養(yǎng)，再作生化試驗(yàn)證實(shí)。表1 MUG勺結(jié)果判斷MUG-I曙紅亞甲藍(lán)瓊脂IMVic 結(jié)果+檢出大腸桿菌- -未檢出大腸桿菌+-無菌生長 未檢出大腸桿菌+ - 有菌生長 -+- 檢出大腸桿菌- + 有菌生長 +- 檢出大腸桿菌注：、如出現(xiàn)+-或出現(xiàn)-+-，均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-I和IMVic試驗(yàn)。革蘭陰性桿菌。（2） 沙門菌 （Salmonella apecies） 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 3份，每份 100ml， 2份分別加入規(guī)定量的供試液， 其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時，陰性對照應(yīng)無菌生長。取其余 2

34、份培養(yǎng)物各1ml，分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10ml中，培養(yǎng)1824小時。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂 （或沙門、志賀菌屬瓊脂 ）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂 （或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 ）培 養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時或延至4048小時。當(dāng)陽性對照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時，供試品的平板 無菌落生長，或有菌落但不同于表 2 所列特征時，可判為未檢出沙門菌。如供試品平板生長的菌落特征有與表2所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，均應(yīng)挑選23個菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面上，陽性對照同時接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)1824小時后，陽性對照的斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色，硫化氫陽性，而供試品的疑似菌斜面未見紅色、底層未見黃色，可判

35、為未檢出沙門菌。否則， 應(yīng)繼續(xù)做以下試驗(yàn)。表 2 沙門菌菌落形態(tài)特征 培養(yǎng)基菌落形態(tài) 膽鹽硫乳瓊脂 無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂 無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的 圓形菌落麥康凱瓊脂 無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色靛基質(zhì)試驗(yàn) 照大腸桿菌項(xiàng)下操作并判斷結(jié)果。脲酶試驗(yàn) 取疑似菌斜面培養(yǎng)物接種于脲瓊脂培養(yǎng)基斜面， 培養(yǎng) 24 小時， 斜面變?yōu)榧t色為陽性， 不變色為 陰性。氰化鉀試驗(yàn) 取培養(yǎng)2024小時的疑似菌株?duì)I養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，分別用白金耳沾取1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化

36、鉀培養(yǎng)基，立即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)2448小時，對照管應(yīng)有菌生長，試驗(yàn)管有菌生長者為陽性，無菌生長為陰性。賴氨酸脫羧酶試驗(yàn) 取疑似菌斜面培養(yǎng)物分別接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時，對照管應(yīng)為黃色，試驗(yàn)管呈紫色為陽性，呈黃色為陰性。動力檢查 取疑似菌斜面培養(yǎng)物穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24 小時， 細(xì)菌沿穿刺外周擴(kuò)散生長，為動力陽性，否則為陰性。陰性培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留23天后，再判斷。血清凝集試驗(yàn) 在潔凈載玻片一端，以白金耳沾取沙門菌屬AF“0”多價血清 23環(huán)，再取斜面上部的培養(yǎng)物少許，與血清混合，將玻片前后側(cè)動，如出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，應(yīng)以0.9%氯化鈉溶液與同株

37、培養(yǎng)物作對照試驗(yàn)，無凝集現(xiàn)象時判為血清凝集陽性。時有反應(yīng)遲緩，需將玻片與濕棉球置平皿內(nèi)，約過20分鐘，再觀察。仍未出現(xiàn)凝集時，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量0.9%氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100C水浴中保溫 30分鐘，待 冷，再作凝集試驗(yàn)。如出現(xiàn)凝集，應(yīng)判為陽性，否則為陰性。上述各項(xiàng)試驗(yàn)反應(yīng)，一般應(yīng)為硫化氫陽性（或陰性 ） ，靛基質(zhì)陰性，脲酶陰性，氰化鉀陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，動力陽性，AF “0”多價血清凝集試驗(yàn)陽性。各鑒定結(jié)果按表3判定。表 3 沙門菌檢查結(jié)果判定序號血清凝集試驗(yàn)（A-F “0”血清）生化試驗(yàn)結(jié)果凝集反應(yīng) 100C30分鐘 0.9%氯化鈉凝集反應(yīng) 溶液對照1 陽性 陰

38、性 符合 檢出沙門菌2 陰性 陽性 陰性 符合 檢出沙門菌3 陰性 陰性 不符合 未檢出沙門菌 上述各項(xiàng)試驗(yàn)任何一項(xiàng)不符合或有可疑反應(yīng)的培養(yǎng)物，均應(yīng)進(jìn)一步鑒定后作出結(jié)論。(3) 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基 3 份，每份 100ml，2 份分別加入規(guī)定量 的供試液，其中1份加入對照菌液作為陽性對照， 第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時，陰性對照應(yīng)無菌生長，其余 2 份培養(yǎng)液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 1824小時。當(dāng)陽性對照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時，供試品的平板無菌落或無疑似菌落生長，可判未檢出銅

39、綠假單胞菌。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍(lán)綠色素擴(kuò)散。如生長菌落具有上述特征或疑似者，應(yīng)挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時，取培養(yǎng)物革蘭染色，并做氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn) 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，再滴 加新配制的 1 二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30 秒內(nèi)呈粉紅色逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。如證實(shí)為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均可判為未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌 素試驗(yàn)。綠膿菌素 (Pyocyanin) 試驗(yàn) 取上述瓊脂培養(yǎng)物，接種于綠

40、膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng) 24 小時后， 在試管內(nèi)加氯仿35ml，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將氯仿移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約 1ml, 振搖后，靜置片刻，如在鹽酸溶液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為綠膿菌素陽性。試驗(yàn)同時應(yīng)作陰性對 照。當(dāng)陰性對照試驗(yàn)呈陰性時， 并為革蘭陰性桿菌、 氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素陽性， 可判檢出銅綠假單胞菌。 綠膿菌素陰性的培養(yǎng)物，應(yīng)繼續(xù)做以下試驗(yàn)。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn) 取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物， 接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中， 培養(yǎng) 24小時， 如在培 養(yǎng)基的杜氏管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性。42'C生長試驗(yàn)取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物于0.9 %無菌

41、氯化鈉溶液中，制成菌懸液，再將菌懸液接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，立即置41C± 1C水浴中培養(yǎng) 2448小時，有菌苔生長者為陽性，否則為陰性。明膠液化試驗(yàn) 以接種針沾取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物， 穿刺于明膠培養(yǎng)基內(nèi)， 培養(yǎng) 24 小時， 取出置冰 箱內(nèi)1030分鐘。如培養(yǎng)基仍呈溶液狀，為陽性。當(dāng)為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性、綠膿菌素試驗(yàn)陰性，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42C生長試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)均為陽性時，應(yīng)判檢出銅綠假單胞菌。（4）金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） 取亞碲酸鈉肉湯 （或營養(yǎng)肉湯） 培養(yǎng)基 3 份，每份 100ml,2 份分別加入規(guī)定量的供試液，其中 1 份加入對照菌液作為陽性對照，第 3份加入與供試液等量的稀釋液作 陰性對照。均培養(yǎng)1824小時（必要時可延至 48小時）。陰性對照應(yīng)無菌生長。取其余 2 份培養(yǎng)液劃線接種于卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基平板或甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基平 板，培養(yǎng)247