微生物限度檢查法

1、微生物限度檢查法微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。 檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。供試品檢查時(shí)，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生 物無(wú)毒性。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30 C35 C；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23 C28 C。檢驗(yàn)結(jié)果以1g

2、、1ml、10g、10ml、10c m2為單位報(bào)告，特殊品種可 以最小包裝單位報(bào)告。檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或c m2）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml ;膜劑為100c m；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門(mén)菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或者10ml用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。供試液的制備供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供

3、試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過(guò)45 C。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基， 不得超過(guò)1小時(shí)。除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。1.液體供試品取供試品10ml，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1 ： 10的 供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。2固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的 方法，混勻，作為1 : 10的供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯 80 ,并置水浴中適當(dāng)加 溫使供試品分散均勻。3.需用特殊

4、供試液制備方法的供試品（1）非水溶性供試品方法1取供試品5g （或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過(guò)45 °C） 5g司盤(pán)80、3g單 硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無(wú)菌混合物的燒杯中， 用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45 C的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為 1 : 20的供試液。方法2取供試品10g ,加至含20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中， 必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 C的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水

5、 層作為1 : 10的供試液。（2）膜劑供試品取供試品100c m2,剪碎，加100ml的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時(shí)可增 加稀釋液），浸泡，振搖，作為1 : 10的供試液。（3）腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或 pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩 沖液（用于結(jié)腸溶制劑） 至100ml ,置45 C水浴中，振搖，使溶解，作為1 : 10的供試液。（4）氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加

6、至適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無(wú)菌聚山梨酯 80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1 : 10的供 試液。（5）貼膏劑供試品取規(guī)定量供試品，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無(wú)菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，制成供試液。貼膏劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。（6）具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性后，再依 法檢查。常用的方法如下

7、。 培養(yǎng)基稀釋法 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液2ml,每1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。 離心沉淀法 取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合，用于細(xì)菌檢查。 薄膜過(guò)濾法見(jiàn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的薄膜過(guò)濾法”。 中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和

8、劑或滅活劑 消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫 水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)。應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌(Escherichia coli ) CMCC ( B)44 102金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) CMCC ( B)26 003枯草芽孢桿菌(Baci

9、llus subtilis ) CMCC ( B) 63 501白色念珠菌(Candida albicans ) CMCC ( F) 98 001黑曲霉(Aspergillus niger ) CMCC ( F)98 003菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)2448小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05%

10、 (v/v)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢 子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05% (v/v)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在 28C可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28C,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。適用性檢查取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制 備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置3035 C培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50 100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即

11、傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328 C培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50100cfu，注入無(wú)菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328 C培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試 驗(yàn)。結(jié)果判定被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。 計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)， 應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證， 以確認(rèn)所 采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、 霉菌及酵母菌數(shù)的

12、測(cè)定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及 菌種及菌3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。液制備同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。（1）試驗(yàn)組 平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液 驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備1ml 和 50 100cfu 試2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗， 在最后一次的沖洗液中加入 50lOOc

13、fu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。（2）菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。（3）供試品對(duì)照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對(duì)照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50lOOcfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。結(jié)果判斷在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率） 應(yīng)均不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌

14、落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌 落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法（表1 ）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。表1常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫納酚類(lèi)、乙醇、吸附物稀釋法醛類(lèi) 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類(lèi)化合物（QACs ）、對(duì)羥基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨酯汞類(lèi)制劑亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類(lèi)化合物卵磷脂酒、洗必泰類(lèi) 聚山梨酯鹵化物硫代硫

15、酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA ）鎂或鈣離子磺胺類(lèi)對(duì)氨基苯甲酸。同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。但是，供試品也可而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的 在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求， 應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，采用上述方法若還存在一株或多株若沒(méi)有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看 成是因供試品的抗菌活性引起的， 能僅對(duì)試驗(yàn)用菌株具有抑制作用， 微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則， 的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。 最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收情況最接近要

16、求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的 檢驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。供試品檢查計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過(guò)濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。控制菌檢查方法的驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)， 檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，依各品種項(xiàng)下 微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn) 行。菌種及菌液制備

17、同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查。驗(yàn)證方法取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果判斷 若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除 供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量同

18、控制菌檢查方法的驗(yàn)證。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10lOOcfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制 菌。陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng) 無(wú)菌生長(zhǎng)。微生物限度標(biāo)準(zhǔn)非無(wú)菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑和對(duì)患者健康潛在的危害以及中 藥的特殊性而制訂的。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷(xiāo)售過(guò)程中的檢驗(yàn)，中藥提取物及輔料的檢驗(yàn)， 新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核， 考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。1.制劑通則、品種項(xiàng)下要求無(wú)菌的制劑及標(biāo)示無(wú)菌的制劑應(yīng)符合無(wú)菌

19、檢查法規(guī)定。2口服給藥制劑2.1不含藥材原粉的制劑細(xì)菌數(shù) 每1g不得過(guò)1OOOcfu。每1ml不得過(guò)100cfu。霉菌和酵母菌數(shù) 每1g或1ml 不得過(guò)100cfu。大腸埃希菌 每1g或1ml不得檢出。2.2含藥材原粉的制劑細(xì)菌數(shù) 每1g不得過(guò)10 OOOcfu （丸劑每1g不得過(guò)30 OOOcfu ）。每1ml不得過(guò)500cfu。 霉菌和酵母菌數(shù) 每1g或1ml不得過(guò)100cfu。大腸埃希菌 每1g或1ml不得檢出。大腸 菌群 每1g應(yīng)小于100個(gè)。每1ml應(yīng)小于10個(gè)。2.3含豆豉、神曲等發(fā)酵原粉的制劑細(xì)菌數(shù) 每1g不得過(guò)100000cfu。每1ml不得過(guò)1000cfu 。霉菌和酵母菌數(shù) 每1g不得過(guò)500cfu。每1ml不得過(guò)100cfu。大腸埃希菌 每1g或1ml不得檢出。大腸菌群 每1g應(yīng)小于100個(gè)。每1ml應(yīng)小于10個(gè)。3局部給藥制劑3.1用于手術(shù)、燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無(wú)菌檢查法規(guī)定。3.