功能性食品的設計方案食科1102班

1、 功能性食品的設計方案：一.設計題目：增強人體免疫力香菇（香菇多糖）二. 香菇多糖提取方案：原理：香菇多糖，是從優(yōu)質(zhì)香菇子實體中提取的有效活性成分，經(jīng)熱水提取的香菇多糖可調(diào)節(jié)人休內(nèi)有免疫功能的T細胞活性，可降低甲基膽蒽誘發(fā)腫瘤的能力，從而提高人體的免疫能力。實驗方法1 提取 將香菇洗凈后除根部后切除根部，菌傘切成小塊，放入真空干燥箱（低溫）烘干，然后將烘干的香菇小塊放在研缽里研磨。 用臺秤量取香菇粉20g，置于250ml燒杯中，加入100ml蒸餾水，于石棉網(wǎng)上加熱至沸，并不斷攪拌，煮沸30min后,抽濾。濾渣再用100ml蒸餾水溶液煮沸30min,抽率。合并兩次濾液，然后將合并后的濾液加熱濃縮

2、至20ml,溶于100ml95乙醇，攪拌并冷卻至室溫，靜置1h。將混合液以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,得到的沉淀放在真空干燥器中干燥，得到粗香菇多糖。2.除蛋白 將得到的粗糖50ml100熱水溶解，加Sevage 溶液 氯仿：正丁醇=5：1（V/V） 10ml,劇烈震動 10mim,靜置10min， 4000r/min離心10min,取上層清液，加Sevage 溶液反復操作5次3.純化 將提取的粗糖置于燒杯中，加蒸餾水50ml溶解，向溶液中加入等體積0.15mol/l的CTAB與硼酸-硼砂緩沖液處理，靜置10min, 4000r/min離心得沉淀用2mol/l乙酸溶解，靜置10mi

3、n, 4000r/min離心后去上清液加等體積甲醇，靜置24h.三香菇多糖注射液的用量及毒理學評價1.用法用量：每周兩次，每次一瓶2ml（含1mg），加入250ml生理鹽水或5%葡萄糖注射液中滴注，或用5%葡萄注射液20ml稀釋后靜注。2.毒理學評價：藥理作用：香菇多糖是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤輔助藥物，能促進T、B淋巴細胞增殖，提高NK細胞活性，從而提高人體免疫能力。毒理研究重復給藥毒性：大鼠、犬和猴重復給藥試驗中均可見網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞腫大和增殖，在大鼠（0.03mg/kg，1個月；0.01mg/kg，3個月）和猴（2mg/kg，6個月）中，可見中小動脈動脈炎，在2mg/kg組中，部分犬和猴

4、有胃腸道或膀胱出血及皮疹和潰瘍。以上病變除大鼠的動脈炎外，僅見于高劑量組，停藥后有恢復趨勢。猴和犬大劑量注射本品可產(chǎn)生泡沫細胞和血管炎，泡沫反應表現(xiàn)過量的多糖進入組織，特別是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。遺傳毒性：本品致突變試驗結果陰性。生殖毒性：雌性大鼠妊娠前給予香菇多糖劑量達1.0mg/kg，未見異常。雄性大鼠給予0.01mg/kg未見授精異常，但在0.1和1.0mg/kg組可見輕至中度授精異常。在大鼠和免器官形成期給藥的試驗中，最大劑量分別為5.0mg/kg和1.0mg/kg，未見致畸作用，但仔鼠斷乳后體重略低。大鼠圍產(chǎn)期和哺乳期給予香菇多糖果劑量達5.0mg/kg時未見異常。四：香菇多糖的功能學評價選

5、取六只生長狀況相近的小鼠，分為三組，每組都用電壓為0.2伏，電流為45微安的電擊設備進行處理，使小鼠的胸腺萎縮，免疫功能下降，然后注射一定量的香菇多糖液，觀察并測定小鼠的免疫力增強情況，相同試驗重復三次。1.試驗項目（動物試驗） （1）體重（絕對體重） （2）臟器體重比值 胸腺體重比值、脾臟體重比值 相對比值越大，免疫能力也越強。 （3）細胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、遲發(fā)型變態(tài)反應 *小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：1. 采用刀豆蛋白A刺激T淋巴細胞，使母細胞發(fā)生增殖反應，活細胞特別是增殖細胞中的線粒體水解酶可將MTT（黃色）分解成藍紫色結晶。2. 721分光光度計570nim測定光密度值

6、0D能反映細胞的增殖情況。3. 受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，結果為陽性，需方差分析。*遲發(fā)型變態(tài)反應：1. 二硝基氟苯(DNFB)稀釋液與腹壁皮膚蛋白結合成完全蛋白，由此刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，47天后，再將其涂抹于耳部進行抗原攻擊，使局部腫脹，一般在抗原攻擊后，2448小時后達到高峰，其腫脹程度可以反應DTH程度。2. 用左右耳的重量之差表示DTH程度，受試樣品組的重量差值顯著高于對照組的重量差值，判斷陽性，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。 (4).體液免疫功能測定：抗體生成細胞檢測，血清溶血素測定*抗體生成細胞檢測：1. 經(jīng)過綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的綿

7、羊紅細胞混合，在補體參與下，使分泌抗體的脾細胞周圍的綿羊紅細胞溶解，形成肉眼可見的空斑。2. 溶血空斑數(shù)反映抗體生成細胞數(shù)，用空斑數(shù)十的六次方 脾細胞數(shù)或空斑數(shù)全脾細胞數(shù)表示，受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)，判斷陽性，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。*血清溶血素測定1. 用綿羊紅細胞免疫細胞后，產(chǎn)生抗綿羊紅細胞的抗體，利用其凝集綿羊紅細胞的程度來檢測溶血素的水平。2. 血清凝集程度一般分為5級，受試樣品組的抗體水平顯著高于對照組的抗體水平，判斷陽性，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。級別顯示：+ 所有紅細胞均凝集-說明凝集能力很強 + 肉眼觀察到的大部分紅細胞凝集-說明凝集能力強+ 部分紅細胞凝集-說明凝

8、集能力屬于中等強度 + 少部分紅細胞凝集-說明凝集能力弱 - 紅細胞完全不凝集（5）單核-巨噬細胞功能測定：小鼠碳廓清試驗，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗*小鼠碳廓清試驗1. 從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨（100ml|kg）立即計時，在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指函數(shù)關系。2. 721分光光度計600nm測血液碳酸鈉溶液的光密度值，采用吞噬指數(shù)表示碳廓清能力，受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，判定陽性，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。吞噬指數(shù)=（體重 肝+脾的重量）×k的三分之一次方 *小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗1. 滴片法：巨噬細胞對光滑表面有粘附的特性

9、，將含有巨噬細胞的腹腔液滴在載玻片上，加入雞紅細胞，孵育一定時間后，沖洗掉未粘附的細胞，固定染色，顯微鏡計數(shù)巨噬細胞數(shù)顯示吞噬細胞率和吞噬指數(shù)。2. 721分光光度計600nm測血液碳酸鈉溶液的光密度值，采用吞噬指數(shù)表示小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力，受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，判定陽性，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。 （六）NK細胞活性測定1. 乳酸脫氫酶測定法：活碳含有的乳酸脫氫酶不能透過碳膜，受到NK殺傷后，乳酸脫氫酶釋放到碳外，可使乳酸鋰脫氫，進而使NAD還原成NADH,NADH再經(jīng)遞氫體PMS還原INT成紫紅色化合物。2.在酶標儀上490nm比色測定光密度值，根據(jù)公式計算

10、NK細胞活性=【（反應孔0D自然釋放孔0D） （最大釋放孔0D 自然釋放孔0D）】×100%，受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，判定陽性，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。2】試驗原則：1. 所有項目均為必測項目2. 采用正?；蛎庖吡Φ拖碌哪Ｐ蛣游镞M行實驗3】結果判定測定項目2-5的結果陽性或任一試驗的兩個劑量組的結果陽性及測定項目6的一個以上劑量組為陽性，則可判定該受試樣品具有免疫調(diào)節(jié)作用。五適宜人群全體人群六自我評價： 轉(zhuǎn)眼間，一學期的功能性食品課程已經(jīng)結束了，回想這一學期的表現(xiàn)，總結如下： 我仍然清楚的記得第一節(jié)課，老師給我們進行的思想教育，課后我也自己思考了好多，明白自己為什么會迷茫，會找不到方向，最主要的原因是缺乏動力和意志力。 因此，以后的每節(jié)課，我都會坐在第一排，認真聽講，不把這堂課當做考查課，而是想著多汲取點知識。對于老師上課提出的問題，我也能認真思考，積級回答，幾乎沒有開過小差，保證了課堂效率，但是課后疏于鞏固，在以后的學習中我會特別注意這一點的。 在做實驗的環(huán)節(jié)中，我每次都會按時到，嚴格按照老師的要求，積極主動的投入實驗中，