低密度脂蛋白對培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞的增殖作用及冬蟲夏草對其的影響

1、    低密度脂蛋白對培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞的 增殖作用及冬蟲夏草對其的影響*        摘要目的：探討腎小球硬化的發(fā)病機(jī)理；并發(fā)現(xiàn)治療腎小球硬化的治療方法。方法：(1)通過測定3H胸腺嘧啶的摻入率，檢測體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞的增殖；(2)對人腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行純化和培養(yǎng)并對低密度、高密度脂蛋白進(jìn)行125I標(biāo)記。結(jié)果：(1)腎小球系膜細(xì)胞選擇性結(jié)合和攝取125ILDL，(2)LDL刺激系膜細(xì)胞增殖且增殖作用具有雙向性，(3)冬蟲夏草對LDL 引起的細(xì)胞增殖具

2、有抑制作用。結(jié)論：LDL刺激系膜細(xì)胞增殖可能直接參與腎小球硬化的發(fā)病，高脂血癥對腎臟的損害可能由腎小球系膜細(xì)胞介導(dǎo)；抑制系膜細(xì)胞增殖可能對腎小球硬化的防治具有一定的可行性。主題詞人類；脂蛋白類，LDL；冬蟲夏草；腎小球硬化癥，病灶性 Proliferation of cultured human mesangial cells caused by LDL and the adserse effect of CordycepsWANG Xiao-Xia, WU Zhao-LongShanghai Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, S

3、hanghai(200032)Abstract AIM:To study the pathogenesis of glomerulosclerosis in vitro and find a treatment method of glomerulosclerosis.METHODS：Human glomerular mesangial cells were purified and cultured: Low density lipoprotein(LDL) and high density lipoprotein (HDL) labelled with125 I; and human me

4、sangial cells（HMC） proliferation measured by counting 3 H thymidine incorporation. RESULTS：(1) Cultured HMC uptake 125 ILDL selectively, (2)LDL stimulated HMC proliferation and had a biphasic effect on HMC proliferation, (3)Cordyceps militaris had a strong inhibition on HMC proliferation induced by

5、LDL. CONCLUSIONS： HMC proliferation induced by LDL may directly participate in the pathogenesis of glomerulosclerosis. The deleterious effects of hyperlipidemia on the kidney may be mediated by HMC. Therefore, inhibiting HMC proliferation may be practicable in the treatment of progressive glomerulos

6、clerosis.MeSHHuman; Lipoproteins, LDL; Glomerulosclerosis, focal; Cordyceps sinensis腎小球硬化是導(dǎo)致腎功能減退的主要因素之一1。研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥與腎小球硬化關(guān)系密切。高脂血癥時，大量脂質(zhì)沉積在系膜細(xì)胞表面引起細(xì)胞 增殖，可能是導(dǎo)致腎小球硬化的關(guān)鍵2，作用機(jī)理還不太清楚。為了在細(xì)胞水平闡明高脂血癥損傷腎小球，導(dǎo)致腎小球硬化的機(jī)理，本實驗利用體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞和125I標(biāo)記的低密度脂蛋白(low density lipoprotein)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein)，研究

7、了系膜細(xì)胞對低密度脂蛋白的結(jié)合和攝取。低密度脂蛋白對系膜細(xì)胞的增殖作用；并首次報道冬蟲夏草對系膜細(xì)胞的影響。材料與方法一、人腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及脂蛋白的分離、標(biāo)記：按美國明尼蘇達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院Morks.Paler教授提供的培養(yǎng)方法。對人腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行了純化及傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行了細(xì)胞鑒定；用密度梯度法分離血液獲得低(高)密度脂蛋白并利用固相氧化法對其分別進(jìn)行125 I標(biāo)記。二、系膜細(xì)胞對標(biāo)記的低密度脂蛋白的結(jié)合和攝取：將第3代細(xì)胞以2×104濃度接種于96孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中(37，5% CO2)孵育34 d細(xì)胞長至半?yún)R合狀態(tài)后，使細(xì)胞處于同步靜止?fàn)顟B(tài)。將10 g/mL碘標(biāo)記

8、的低高密度脂蛋白分別加入培養(yǎng)板孔內(nèi)(n=8)，設(shè)空白對照，孵育5 h后，4 Hanks液充分漂洗：4 0.5%三氯甲烷充分漂洗，用1 mol/L NaOH溶解細(xì)胞，室溫下置24 h，收集細(xì)胞碎片，烘干濾紙進(jìn)行放射計數(shù)測定。三、低密度脂蛋白對系膜細(xì)胞增殖作用的影響：漿系膜細(xì)胞同步靜止后，加入不同濃度的低密度脂蛋白(5 g/mL，10 g/mL，50 g/L，100 g/mL，150 g/mL，200 g/mL，n=8)。每孔按 3.7×104 Bq加入3H胸腺嘧啶，設(shè)對照組。孵育24 h(37，5% CO2)，Hanks液充分漂洗及5%三氯乙酸洗滌，0.5%胰蛋白酶及0.02% EDT

9、A(1：1)溶液溶解細(xì)胞，收集細(xì)胞碎片，進(jìn)行放射計數(shù)測定。四、冬早夏草對低密度脂蛋白產(chǎn)生的系膜細(xì)胞增殖的影響：系膜細(xì)胞同步靜止化后，加入不同濃度(100 g/mL，200 g/mL， 300 g/mL， 400 g/mL)的天然冬蟲夏草，3.7×104 Bq/孔的3H胸腺嘧啶及10 g/mL的低密度脂蛋白共同孵育24 h；北冬蟲夏草(人工合成)實驗組方法同上并同時設(shè)實驗對照組：以下漂洗及溶解，收集細(xì)胞碎片，同位素計數(shù)測定。五、統(tǒng)計方法：數(shù)據(jù)以表示，采用t檢驗和方差分析。結(jié)果(一)系膜細(xì)胞的鑒定和脂蛋白的分離及標(biāo)記結(jié)果：免疫組化標(biāo)記結(jié)果、胞漿內(nèi)結(jié)蛋白(desmin)、肌動蛋白(acti

10、n)、肌球蛋白(myosin)均為陽性表達(dá)、因子(F8)及角蛋白(cytokeratin)陰性。血漿脂蛋白的分離結(jié)果顯示：碘標(biāo)記的低(高)密度脂蛋白的放化純度均達(dá)98.7%。(二)系膜細(xì)胞對碘標(biāo)記的低密度脂蛋白的結(jié)合攝?。航Y(jié)果顯示：低密度脂蛋白組的放射counts.min-1(7304.0±974.0，n=8)明顯高于高密度脂蛋白組(303.0±35.0，n=8)，P0.01。(三)低密度脂蛋白對系膜細(xì)胞增殖作用的影響：見表1。表1不同濃度低密度脂蛋白對系膜細(xì)胞的影響Tab 1The effect of different concentration of LDL(low

11、density lipoprotein) on mesangial cells(,n=8)GroupConcentration of LDL(g/mL)Counts.min-1Control062.5±18.3LDL5919.5±216.0*101106.0±132.0*501200.0±311.0*1001690.0±307.0*150511.8±105.0*200456.1±115.0*P0.05,*P0.01, vs control(四)北冬蟲夏草及天然冬蟲夏草對低密度脂蛋白產(chǎn)生的系膜細(xì)胞增殖的影響：見表2。表2冬蟲夏

12、草對LDL引起的系膜細(xì)胞增殖的影響Tab 2The effect of Cordyceps on proliferation of mesangial cells caused by LDL(,n=8)GroupCounts.min-1Blank20.0±6.0LDL (10 g/mL)1106.0±132.0Cordyceps sinenis (g/mL)+LDL(g/mL)100+10192.0±25.0*200+10168.0±16.0*300+10145.0±20.0*400+1072.0±16.0*Cordyceps mil

13、itaris (g/mL)+LDL(g/mL)100+1099.5±21.0*200+1080.2±11.0*300+1079.8±19.0*400+1070.3±8.0*P0.05,*P0.01, vs LDL討論腎小球固有細(xì)胞有3種：臟層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞，實驗的培養(yǎng)鑒定結(jié)果顯示傳代培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞純度極高，不含有上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。125I標(biāo)記的低密度脂蛋白與系膜細(xì)胞親和力高，并與細(xì)胞特異性結(jié)合，肝素及過量未標(biāo)記的低密度脂量白均能阻斷二者的結(jié)合4。我們的實驗結(jié)果顯示：125I標(biāo)記的低密度脂蛋白組的counts.min-1計數(shù)

14、明顯高于高密度脂蛋白組，統(tǒng)計結(jié)果具有顯著差異。故脂蛋白對系膜細(xì)胞的作用可能主要通過低密度脂蛋白，此項結(jié)果為系膜細(xì)胞通過特異性受體結(jié)合機(jī)制結(jié)合和攝取低密度脂蛋白提供了有力證據(jù)。不同濃度的低密度脂蛋白組3H胸腺嘧啶摻入量明顯高于實驗對照組，低密度脂蛋白能夠刺激系膜細(xì)胞增殖，且具有雙向性：550 g/mL濃度時，細(xì)胞增殖顯著，100200 g/mL濃度時，細(xì)胞增殖受到抑制。目前認(rèn)為，這種增殖作用與血小板生長因子有關(guān)3，增殖的雙向性，有作者認(rèn)為可能與高濃度低密度脂蛋白對細(xì)胞的毒性作用和刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2有關(guān)5，6。腎小球超微結(jié)構(gòu)顯示系膜細(xì)胞與球內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮直接接觸，毛細(xì)血管內(nèi)皮裂隙直徑為4

15、0 nm,低密度脂蛋白顆粒平均直徑為20 nm，因此血液中的低密度脂蛋白可以濾出。研究表明，高脂血癥發(fā)生時，腎小球毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，低密度脂蛋白濾出，與系膜細(xì)胞結(jié)合，刺激細(xì)胞增殖，同時刺激細(xì)胞合成大量系膜基質(zhì)，表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1，合成有生物活性的趨化蛋白，使單核細(xì)胞合成許多細(xì)胞因子，如血小板生長因子，轉(zhuǎn)移生長因子，而這些細(xì)胞因子刺激系膜細(xì)胞增殖及系膜基質(zhì)合成68，從而引起腎小球硬化，因此，高脂血癥與腎小球硬化關(guān)系極為密切。本實驗結(jié)果表明天然冬蟲夏草及北冬蟲夏草對低密度脂蛋白引起的系膜細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。其作用機(jī)理，有作者認(rèn)為是冬蟲夏草抑制了細(xì)胞增殖過程中mRNA的合成9。我

16、們的實驗結(jié)果則表明是抑制了DNA的合成，可能是由于冬蟲夏草與系膜細(xì)胞共同孵育的時間延長，抑制mRNA合成的同時，間接抑制了DNA的合成。從實驗結(jié)果顯然可以看出，2種藥物的抑制作用無顯著差異。但人工培植的冬蟲夏草來源廣泛，價格低廉，可以在臨床廣泛推廣來防治腎小球硬化。(致謝：感謝杭州中美合資華東制藥廠和上海醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所程文英教授提供冬蟲夏草)*衛(wèi)生部基金資助作者單位：上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院腎內(nèi)科(上海200032)參考文獻(xiàn)1Anderson S, Brenner BM. Progressive renal disease: a disorder of adaptation. Q J Me

17、d, 1989, 70: 185.2Kasiske BL， O'Donnell MP, Clearly MP, et al. Treatment of hyperlipidemia reduces glomerular injury in obese Zuckers rats. Kidney Int, 1988,33: 667.3Grone EF, Abboud HE, Hobne M, et al. Actions of lipoproteins in cultured human mesangial cells: modulation by mitogenic vasoconstr

18、ictors. Am J Physiol, 1992,263: 686.4Rayner HC, Horsburgh T, Brown SL, et al. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein by cultured human glomerular cells. Nephron, 1990,55:292.5Wasserman J, Santiago A, Rifici V, et al. Interactions of low density lipoprotein with rat mesangial cells. Kidney I