低密度脂蛋白對培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞的增殖作用及冬蟲夏草對其的影響

1、    低密度脂蛋白對培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞的 增殖作用及冬蟲夏草對其的影響*        摘要目的：探討腎小球硬化的發(fā)病機理；并發(fā)現(xiàn)治療腎小球硬化的治療方法。方法：(1)通過測定3H胸腺嘧啶的摻入率，檢測體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞的增殖；(2)對人腎小球系膜細胞進行純化和培養(yǎng)并對低密度、高密度脂蛋白進行125I標記。結(jié)果：(1)腎小球系膜細胞選擇性結(jié)合和攝取125ILDL，(2)LDL刺激系膜細胞增殖且增殖作用具有雙向性，(3)冬蟲夏草對LDL 引起的細胞增殖具

2、有抑制作用。結(jié)論：LDL刺激系膜細胞增殖可能直接參與腎小球硬化的發(fā)病，高脂血癥對腎臟的損害可能由腎小球系膜細胞介導；抑制系膜細胞增殖可能對腎小球硬化的防治具有一定的可行性。主題詞人類；脂蛋白類，LDL；冬蟲夏草；腎小球硬化癥，病灶性 Proliferation of cultured human mesangial cells caused by LDL and the adserse effect of CordycepsWANG Xiao-Xia, WU Zhao-LongShanghai Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, S

3、hanghai(200032)Abstract AIM:To study the pathogenesis of glomerulosclerosis in vitro and find a treatment method of glomerulosclerosis.METHODS：Human glomerular mesangial cells were purified and cultured: Low density lipoprotein(LDL) and high density lipoprotein (HDL) labelled with125 I; and human me

4、sangial cells（HMC） proliferation measured by counting 3 H thymidine incorporation. RESULTS：(1) Cultured HMC uptake 125 ILDL selectively, (2)LDL stimulated HMC proliferation and had a biphasic effect on HMC proliferation, (3)Cordyceps militaris had a strong inhibition on HMC proliferation induced by

5、LDL. CONCLUSIONS： HMC proliferation induced by LDL may directly participate in the pathogenesis of glomerulosclerosis. The deleterious effects of hyperlipidemia on the kidney may be mediated by HMC. Therefore, inhibiting HMC proliferation may be practicable in the treatment of progressive glomerulos

6、clerosis.MeSHHuman; Lipoproteins, LDL; Glomerulosclerosis, focal; Cordyceps sinensis腎小球硬化是導致腎功能減退的主要因素之一1。研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥與腎小球硬化關(guān)系密切。高脂血癥時，大量脂質(zhì)沉積在系膜細胞表面引起細胞 增殖，可能是導致腎小球硬化的關(guān)鍵2，作用機理還不太清楚。為了在細胞水平闡明高脂血癥損傷腎小球，導致腎小球硬化的機理，本實驗利用體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞和125I標記的低密度脂蛋白(low density lipoprotein)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein)，研究

7、了系膜細胞對低密度脂蛋白的結(jié)合和攝取。低密度脂蛋白對系膜細胞的增殖作用；并首次報道冬蟲夏草對系膜細胞的影響。材料與方法一、人腎小球系膜細胞的培養(yǎng)、鑒定及脂蛋白的分離、標記：按美國明尼蘇達大學醫(yī)學院Morks.Paler教授提供的培養(yǎng)方法。對人腎小球系膜細胞進行了純化及傳代培養(yǎng)，并進行了細胞鑒定；用密度梯度法分離血液獲得低(高)密度脂蛋白并利用固相氧化法對其分別進行125 I標記。二、系膜細胞對標記的低密度脂蛋白的結(jié)合和攝?。簩⒌?代細胞以2×104濃度接種于96孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中(37，5% CO2)孵育34 d細胞長至半?yún)R合狀態(tài)后，使細胞處于同步靜止狀態(tài)。將10 g/mL碘標記

8、的低高密度脂蛋白分別加入培養(yǎng)板孔內(nèi)(n=8)，設(shè)空白對照，孵育5 h后，4 Hanks液充分漂洗：4 0.5%三氯甲烷充分漂洗，用1 mol/L NaOH溶解細胞，室溫下置24 h，收集細胞碎片，烘干濾紙進行放射計數(shù)測定。三、低密度脂蛋白對系膜細胞增殖作用的影響：漿系膜細胞同步靜止后，加入不同濃度的低密度脂蛋白(5 g/mL，10 g/mL，50 g/L，100 g/mL，150 g/mL，200 g/mL，n=8)。每孔按 3.7×104 Bq加入3H胸腺嘧啶，設(shè)對照組。孵育24 h(37，5% CO2)，Hanks液充分漂洗及5%三氯乙酸洗滌，0.5%胰蛋白酶及0.02% EDT

9、A(1：1)溶液溶解細胞，收集細胞碎片，進行放射計數(shù)測定。四、冬早夏草對低密度脂蛋白產(chǎn)生的系膜細胞增殖的影響：系膜細胞同步靜止化后，加入不同濃度(100 g/mL，200 g/mL， 300 g/mL， 400 g/mL)的天然冬蟲夏草，3.7×104 Bq/孔的3H胸腺嘧啶及10 g/mL的低密度脂蛋白共同孵育24 h；北冬蟲夏草(人工合成)實驗組方法同上并同時設(shè)實驗對照組：以下漂洗及溶解，收集細胞碎片，同位素計數(shù)測定。五、統(tǒng)計方法：數(shù)據(jù)以表示，采用t檢驗和方差分析。結(jié)果(一)系膜細胞的鑒定和脂蛋白的分離及標記結(jié)果：免疫組化標記結(jié)果、胞漿內(nèi)結(jié)蛋白(desmin)、肌動蛋白(acti

10、n)、肌球蛋白(myosin)均為陽性表達、因子(F8)及角蛋白(cytokeratin)陰性。血漿脂蛋白的分離結(jié)果顯示：碘標記的低(高)密度脂蛋白的放化純度均達98.7%。(二)系膜細胞對碘標記的低密度脂蛋白的結(jié)合攝?。航Y(jié)果顯示：低密度脂蛋白組的放射counts.min-1(7304.0±974.0，n=8)明顯高于高密度脂蛋白組(303.0±35.0，n=8)，P0.01。(三)低密度脂蛋白對系膜細胞增殖作用的影響：見表1。表1不同濃度低密度脂蛋白對系膜細胞的影響Tab 1The effect of different concentration of LDL(low

11、density lipoprotein) on mesangial cells(,n=8)GroupConcentration of LDL(g/mL)Counts.min-1Control062.5±18.3LDL5919.5±216.0*101106.0±132.0*501200.0±311.0*1001690.0±307.0*150511.8±105.0*200456.1±115.0*P0.05,*P0.01, vs control(四)北冬蟲夏草及天然冬蟲夏草對低密度脂蛋白產(chǎn)生的系膜細胞增殖的影響：見表2。表2冬蟲夏

12、草對LDL引起的系膜細胞增殖的影響Tab 2The effect of Cordyceps on proliferation of mesangial cells caused by LDL(,n=8)GroupCounts.min-1Blank20.0±6.0LDL (10 g/mL)1106.0±132.0Cordyceps sinenis (g/mL)+LDL(g/mL)100+10192.0±25.0*200+10168.0±16.0*300+10145.0±20.0*400+1072.0±16.0*Cordyceps mil

13、itaris (g/mL)+LDL(g/mL)100+1099.5±21.0*200+1080.2±11.0*300+1079.8±19.0*400+1070.3±8.0*P0.05,*P0.01, vs LDL討論腎小球固有細胞有3種：臟層上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞和系膜細胞，實驗的培養(yǎng)鑒定結(jié)果顯示傳代培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞純度極高，不含有上皮細胞及內(nèi)皮細胞。125I標記的低密度脂蛋白與系膜細胞親和力高，并與細胞特異性結(jié)合，肝素及過量未標記的低密度脂量白均能阻斷二者的結(jié)合4。我們的實驗結(jié)果顯示：125I標記的低密度脂蛋白組的counts.min-1計數(shù)

14、明顯高于高密度脂蛋白組，統(tǒng)計結(jié)果具有顯著差異。故脂蛋白對系膜細胞的作用可能主要通過低密度脂蛋白，此項結(jié)果為系膜細胞通過特異性受體結(jié)合機制結(jié)合和攝取低密度脂蛋白提供了有力證據(jù)。不同濃度的低密度脂蛋白組3H胸腺嘧啶摻入量明顯高于實驗對照組，低密度脂蛋白能夠刺激系膜細胞增殖，且具有雙向性：550 g/mL濃度時，細胞增殖顯著，100200 g/mL濃度時，細胞增殖受到抑制。目前認為，這種增殖作用與血小板生長因子有關(guān)3，增殖的雙向性，有作者認為可能與高濃度低密度脂蛋白對細胞的毒性作用和刺激系膜細胞產(chǎn)生前列腺素E2有關(guān)5，6。腎小球超微結(jié)構(gòu)顯示系膜細胞與球內(nèi)毛細血管內(nèi)皮直接接觸，毛細血管內(nèi)皮裂隙直徑為4

15、0 nm,低密度脂蛋白顆粒平均直徑為20 nm，因此血液中的低密度脂蛋白可以濾出。研究表明，高脂血癥發(fā)生時，腎小球毛細血管通透性增強，低密度脂蛋白濾出，與系膜細胞結(jié)合，刺激細胞增殖，同時刺激細胞合成大量系膜基質(zhì)，表達單核細胞趨化蛋白MCP-1，合成有生物活性的趨化蛋白，使單核細胞合成許多細胞因子，如血小板生長因子，轉(zhuǎn)移生長因子，而這些細胞因子刺激系膜細胞增殖及系膜基質(zhì)合成68，從而引起腎小球硬化，因此，高脂血癥與腎小球硬化關(guān)系極為密切。本實驗結(jié)果表明天然冬蟲夏草及北冬蟲夏草對低密度脂蛋白引起的系膜細胞增殖有明顯的抑制作用。其作用機理，有作者認為是冬蟲夏草抑制了細胞增殖過程中mRNA的合成9。我

16、們的實驗結(jié)果則表明是抑制了DNA的合成，可能是由于冬蟲夏草與系膜細胞共同孵育的時間延長，抑制mRNA合成的同時，間接抑制了DNA的合成。從實驗結(jié)果顯然可以看出，2種藥物的抑制作用無顯著差異。但人工培植的冬蟲夏草來源廣泛，價格低廉，可以在臨床廣泛推廣來防治腎小球硬化。(致謝：感謝杭州中美合資華東制藥廠和上海醫(yī)科大學放射醫(yī)學研究所程文英教授提供冬蟲夏草)*衛(wèi)生部基金資助作者單位：上海醫(yī)科大學中山醫(yī)院腎內(nèi)科(上海200032)參考文獻1Anderson S, Brenner BM. Progressive renal disease: a disorder of adaptation. Q J Me

17、d, 1989, 70: 185.2Kasiske BL， O'Donnell MP, Clearly MP, et al. Treatment of hyperlipidemia reduces glomerular injury in obese Zuckers rats. Kidney Int, 1988,33: 667.3Grone EF, Abboud HE, Hobne M, et al. Actions of lipoproteins in cultured human mesangial cells: modulation by mitogenic vasoconstr

18、ictors. Am J Physiol, 1992,263: 686.4Rayner HC, Horsburgh T, Brown SL, et al. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein by cultured human glomerular cells. Nephron, 1990,55:292.5Wasserman J, Santiago A, Rifici V, et al. Interactions of low density lipoprotein with rat mesangial cells. Kidney I