PCR擴(kuò)增過程中常見的問題及解決方法1

1、PCRPCR擴(kuò)增過程中常擴(kuò)增過程中常見的問題及解決方見的問題及解決方法法檢驗(yàn)科檢驗(yàn)科 劉芳娜劉芳娜一、假陽性擴(kuò)增二、假陰性擴(kuò)增三、實(shí)驗(yàn)室污染 PCR技術(shù)具有高度的特異性、選擇性、靈敏性，而且快速、簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，因此在臨床醫(yī)學(xué)工作中受到廣泛的重視及合理的應(yīng)用。PCR技術(shù)很簡(jiǎn)單，原理也很清楚，但畢竟PCR技術(shù)是一種新生事物，受到許多條件因素的影響，所以要做得好也不容易。在PCR技術(shù)應(yīng)用過程中會(huì)遇到這樣或那樣的問題，更甚至?xí)玫脚c事實(shí)完成相反的結(jié)果。為了使我們能夠順利地開展PCR工作，更好地發(fā)揮PCR技術(shù)的工具作用，現(xiàn)將PCR擴(kuò)增過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一些問題進(jìn)行簡(jiǎn)要的總結(jié)，不足之處歡迎指正。 一、假

2、陽性擴(kuò)增一、假陽性擴(kuò)增 在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)會(huì)碰到所檢驗(yàn)的樣本全部陽性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶亮度均一，這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染時(shí)最典型的一種表現(xiàn)，需仔細(xì)檢查，排除污染源，一般應(yīng)從以下步驟著手： 試劑污染： 廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運(yùn)輸、貯存過程中受到污染。檢測(cè)方法，可按試劑盒說明書將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴(kuò)增（不加陰性對(duì)照，可加適量蒸餾水），便可簡(jiǎn)單而有效地判斷試劑是否已受到污染。 一、假陽性擴(kuò)增一、假陽性擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)室污染： 這是最常見的污染源，由于PCR技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將模板中某些特異性序列擴(kuò)增到數(shù)百萬倍以上，擴(kuò)增產(chǎn)物可能在電泳等過程中污染移液器、操作臺(tái)或隨著蒸發(fā)所形成氣溶

3、膠而污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。擴(kuò)增產(chǎn)物又是最有效的模板，一旦出現(xiàn)產(chǎn)物污染其污染程度都較嚴(yán)重。判斷方法：可以將實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中或轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)中完成。當(dāng)然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應(yīng)徹底更換。一、假陽性擴(kuò)增一、假陽性擴(kuò)增解決方法：實(shí)驗(yàn)室污染是PCR擴(kuò)增過程中最易出現(xiàn)的現(xiàn)象，而且一旦出現(xiàn)污染，消除污染源又極其困難，往往需對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材徹底清洗處理，所以應(yīng)該以預(yù)防為主，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)基本要求，樣品處理與擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳應(yīng)盡量分開，最好能在兩個(gè)房間進(jìn)行。擴(kuò)增前處理所用的移液器及擴(kuò)增后點(diǎn)樣用的移液器應(yīng)嚴(yán)格地分開，不可互換。PCR室應(yīng)保持良好的通風(fēng)、

4、清潔、最好能專用。 一、假陽性擴(kuò)增一、假陽性擴(kuò)增采樣污染： 在實(shí)驗(yàn)過程中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一批結(jié)果陽性率很高，一批結(jié)果陽性率又下降很多，如此反復(fù)，這種現(xiàn)象大都是由于采樣時(shí)污染所致，一般來講正規(guī)試劑生產(chǎn)廠家，其試劑出廠時(shí)都要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)、批間，特別是批內(nèi)差異都極小，不致出現(xiàn)如此明顯的反復(fù)，這種現(xiàn)象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。PCR擴(kuò)增非常敏感，而一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)重復(fù)使用的試管所進(jìn)行的洗滌方法往注不能去除痕量DNA，這些痕量DNA便成為PCR模板，出現(xiàn)陽性擴(kuò)增結(jié)果，由于采樣試管受污染程度不一，所以出現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象解決方法建議使用一次試管及吸咀取樣。 二、假陰性擴(kuò)增二、假陰性擴(kuò)增如果連

5、續(xù)幾次擴(kuò)增結(jié)果都是陰性，或已知陽性樣本出現(xiàn)陰性擴(kuò)增結(jié)果，一般認(rèn)為這是假陰性，出現(xiàn)這現(xiàn)象有以下幾種原因： 儀器故障： 出現(xiàn)全陰結(jié)果，首先考慮到儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎(chǔ)，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常是PCR擴(kuò)增最關(guān)鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常，首先要測(cè)定加熱體的溫度是否準(zhǔn)確，波動(dòng)范圍是否答合要求，各孔之間差異是否符合要求，PCR擴(kuò)增往往對(duì)儀器加熱溫度及各管間的差異要求有很高的精度，如果誤差太大，勢(shì)必出現(xiàn)假陰性。必須注意的是不能過信名牌，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些名牌機(jī)器溫度差異高達(dá)二度以上。 二、假陰性擴(kuò)增二、假陰性擴(kuò)增試劑失效或無效： 了解機(jī)器是否正常，便可對(duì)試劑進(jìn)行檢測(cè)

6、。首先要了解試劑是否超過有效期，試存放方法是否達(dá)到要求，如果試劑盒在有效期內(nèi)，貯存方法是正確，那么就應(yīng)該仔細(xì)、慎重地判斷試劑是否是無效試劑或稱不合格試劑?？梢杂靡阎栃詷颖荆蛟噭┖刑峁┑年栃詫?duì)照，嚴(yán)格按說明書操作擴(kuò)增一次，然后把擴(kuò)增產(chǎn)物用雙蒸水稀釋1000倍，作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，判斷結(jié)果，如果是陰性說明試劑無效或不合格，如果結(jié)果陽性那么可用以下方法判定試劑的靈敏度。 二、假陰性擴(kuò)增二、假陰性擴(kuò)增3.離心機(jī)問題離心機(jī)的質(zhì)量或使用不正確，造成離心標(biāo)本模板沒有分離出來造成假陰性，切以為這是最易被忽視的問題。其時(shí)離心機(jī)使用問題不僅在PCR，在整個(gè)檢驗(yàn)工作中都是最易被忽視的問題，只是因?yàn)樵谄渌ぷ?/p>

7、中不象PCR那樣明顯影響檢測(cè)結(jié)果罷了。離心機(jī)是常用的固液分離設(shè)備，其利用離心過程中的離心力而將密度不同的物質(zhì)分離出來。因此離心機(jī)的關(guān)鍵在于離心加速度而不是轉(zhuǎn)速，根據(jù)牛頓定律可知離心力加速度與轉(zhuǎn)速和有效半徑的有關(guān)的，因此對(duì)于不同有效半徑的離心機(jī)相同的轉(zhuǎn)速其離心加速度是不同的，轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)要因離心機(jī)而異，但很遺憾，日常工作中忽視了這個(gè)問題。二、假陰性擴(kuò)增二、假陰性擴(kuò)增有效半徑短的離心加速度就小，同樣的時(shí)間離心效果就差可能造成分離不出導(dǎo)致假陰性。同時(shí)由于高速離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)與空氣摩擦?xí)a(chǎn)生大量的熱，因此對(duì)于稱能上幾萬轉(zhuǎn)/分而沒有抽真空的離心機(jī)實(shí)際轉(zhuǎn)速本人持懷疑態(tài)度。4.操作者失誤操作問題造成標(biāo)本DNA沒

8、有暴露出來，致使擴(kuò)增無法進(jìn)行，這是造成假陰性的又一主要因素。三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染PCR實(shí)驗(yàn)室污染主要是下面四個(gè)方面(一) 標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。 (二) PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染(三) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題

9、。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。 還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染(四) 實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見，因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過

10、程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染污染的監(jiān)測(cè) 一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。在進(jìn)行監(jiān)測(cè)前用消毒液擦拭工作臺(tái)面，打開所有的紫外燈照射一天，將所使用微量進(jìn)樣器、離心管、槍頭、手套、記號(hào)筆、記錄本等都更換掉，再將HBV標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。 對(duì)照試驗(yàn) 1、陽性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染

11、實(shí)驗(yàn)室污染陽性 對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)。但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。 2、陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染3、重復(fù)性試驗(yàn) 4、選擇不同區(qū)域的

12、引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染防止污染的方法 進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。 (一) 劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行： 1. 試劑準(zhǔn)備區(qū)。 2標(biāo)本制備區(qū)。 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染3. PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：試劑準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)制備PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。 切記：任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)

13、。 (二) 分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA： 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 三、三、實(shí)驗(yàn)室污染實(shí)驗(yàn)室污染3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR