laballiance培訓(xùn)教材

1、液相色譜培訓(xùn)教材 天津蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司 2011.04主要內(nèi)容v液相色譜儀的基本原理v液相色譜儀的操作過程與一般規(guī)則vLabAlliance 液相色譜儀組成與使用方法v常見使用故障及維護(hù)vLabAlliance液相系統(tǒng)在三聚氰胺檢測(cè)中的應(yīng)用 液相色譜儀的基本原理v早在年，俄國(guó)的植物學(xué)家茨維特將含有植物色素的石油醚溶液倒入一根內(nèi)部填充著碳酸鈣粉末的玻璃管中，再不斷用石油醚淋洗，隨著石油醚的不斷下降，玻璃管中形成了不同顏色的譜帶，從而成功地將不同的色素分離開來?！吧V”也就由此而得名。v淋洗用的石油醚稱為流動(dòng)相，玻璃管中的碳酸鈣稱為固定相，玻璃管稱為色譜柱，后來這種方法廣泛地應(yīng)用于多種混合

2、物的分離，并成為一種很重要的儀器分析方法。v色譜法(chromatography)是一種物理、化學(xué)的分離、分析方法。它利用混合物各組分在互相接觸的固定相和流動(dòng)相中有不同的分配比（或吸附能力的差異），當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些組分在兩相中多次反復(fù)分配平衡，從而使各組分得到分離，然后按順序被檢測(cè)。液相色譜儀原理示意圖流動(dòng)相進(jìn)樣器色譜柱工作站時(shí)間檢測(cè)器v組分從色譜柱流出時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)大小隨時(shí)間變化所形成的曲線叫色譜圖，它是定性、定量分析和評(píng)價(jià)色譜分離情況的基本依據(jù)液相色譜儀需要了解的幾個(gè)概念液相色譜儀需要了解的幾個(gè)概念v保留時(shí)間（tR）：自進(jìn)樣至出現(xiàn)色譜峰最高點(diǎn)所用的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，以分鐘Mi

3、n為單位v峰高（h）： 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離。以mv或mAu表示。v峰面積（）： 由峰和峰底之間圍成的面積。峰面積被用作定量分析的指標(biāo)。v理論塔板數(shù)(TP)：色譜的柱效參數(shù)之一,用于定量表示色譜柱的分離效率v液相色譜儀的操作過程與注意事項(xiàng)液相色譜分析流程-開機(jī)平衡1.開機(jī)：依次打開泵、檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、工作站電源，在電腦上雙擊工作站圖標(biāo)進(jìn)入工作站主界面。2.用5%甲醇（或5%乙腈）沖洗色譜柱15分鐘3.換上流動(dòng)相，設(shè)定好參數(shù)（波長(zhǎng)，柱溫，流速，采樣時(shí) 間等）后開泵，平衡系統(tǒng)大約30分鐘到小時(shí)三聚氰胺1. 對(duì)于三聚氰胺的檢測(cè)，波長(zhǎng)設(shè)為240nm,柱溫400C,流速1.0ml/

4、min，采樣時(shí)間設(shè)為20-30min（根據(jù)出峰時(shí)間而定）2. 平衡時(shí)間以基線走平為準(zhǔn)，只要基線平直就可以運(yùn)行進(jìn)樣程序。液相色譜分析流程-進(jìn)樣分析1.按國(guó)標(biāo)要求進(jìn)不同濃度標(biāo)樣，得到一系列譜圖，用濃度與峰面積的值導(dǎo)出線性方程。計(jì)算該線性方程的R2值2.進(jìn)處理好的樣品。得樣品峰譜圖。3.將樣品峰面積代入線性方程和國(guó)標(biāo)公式，計(jì)算含量。得到樣品中被測(cè)物的含量。液相色譜分析流程-沖洗系統(tǒng)1.進(jìn)完樣品后，將流動(dòng)相換成5%甲醇水溶液沖柱1小時(shí)，目的是為了徹底洗去系統(tǒng)中殘留的緩沖鹽2.將5%甲醇水溶液換成100%甲醇沖洗30分鐘。3.停泵，關(guān)機(jī)，關(guān)電源。液相色譜分析流程-沖洗系統(tǒng)注意：1. 做完實(shí)驗(yàn)后系統(tǒng)中存在

5、含鹽流動(dòng)相的情況下，萬萬不可直接將甲醇或乙腈導(dǎo)入系統(tǒng)中，因?yàn)榇蟛糠志彌_鹽在甲醇或乙腈中是不溶的，從而導(dǎo)致鹽析出，損壞儀器。2. 用5%甲醇而不用純水是為了保護(hù)色譜柱。 液相色譜分析流程-三聚氰胺平衡，沖洗方法 針對(duì)三聚氰胺的流動(dòng)相中含有的離子對(duì)緩沖鹽的情況，我們建議在做完實(shí)驗(yàn)之后用同樣比例不含鹽的乙腈：水=15:85或是10:90沖洗系統(tǒng)1小時(shí)，然換成50：50的乙腈：水沖洗30分鐘后關(guān)機(jī)，再次做實(shí)驗(yàn)時(shí)，直接用流動(dòng)相平衡系統(tǒng)即可。長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，再用純甲醇沖洗，保存。操作注意事項(xiàng)-流動(dòng)相1. 流動(dòng)相須現(xiàn)用現(xiàn)配。2. 使用HPLC級(jí)或相當(dāng)于該級(jí)別的流動(dòng)相，并要先經(jīng)0.45m薄膜過濾。3. 如有仍有

6、氣泡產(chǎn)生，還需超聲15分鐘。4. 在使用儀器過程中，注意貯液瓶里的流動(dòng)相是否夠用，在一次分析中，不要加注流動(dòng)相，加注或更換后需重新平衡。操作注意事項(xiàng)-電源1. 電壓需保持穩(wěn)定，配3KW凈化穩(wěn)壓電源防止電壓不穩(wěn)對(duì)儀器造成傷害。2. 地線。必須確保獨(dú)立地線已連接好，否則會(huì)增加基線噪聲，造成靈敏度下降，甚至無法分析。3. 不能短時(shí)間內(nèi)反復(fù)開關(guān)機(jī)。尤其是紫外檢測(cè)器，兩次開關(guān)機(jī)時(shí)間間隔5分鐘以上。4. 由于液相色譜組件較多，請(qǐng)選用質(zhì)量較好的接線板，防止虛接造成瞬間電流過大，損壞儀器。操作注意事項(xiàng)- 色譜柱1、色譜柱的保存 （1）反相色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用5%的甲

7、醇/水沖洗60分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入5%的甲醇。 （2）長(zhǎng)期保存色譜柱：如色譜柱要長(zhǎng)時(shí)間保存，必須存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以儲(chǔ)存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chǔ)存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購(gòu)買新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲(chǔ)存的溫度最好是室溫。操作注意事項(xiàng)- 色譜柱2. 更換色譜柱時(shí)，需將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則將產(chǎn)生死體積，引起峰展寬，或是肩峰。 操作注意事項(xiàng)-自清洗液v在線自清洗。在線自清洗是SSI的專利設(shè)計(jì) ，其的作用的是為了自動(dòng)清潔泵頭

8、柱塞，延長(zhǎng)其使用壽命，自清洗液為20%的甲醇溶液，在用含鹽流動(dòng)相時(shí)，建議每三天更換一次，不含鹽時(shí)每周換一次，達(dá)到最好的清洗效果。小結(jié)：v必須嚴(yán)格按照上述操作規(guī)程進(jìn)行操作，才能避免損壞儀器。vLabAlliance 液相色譜儀組成與使用方法液相色譜儀原理示意圖 高效液相色譜系統(tǒng)v 泵泵 v 進(jìn)樣器v 色譜柱（柱溫箱）v 檢測(cè)器v 工作站v 柱后衍生裝置液相色譜泵外觀圖高壓自清洗泵調(diào)節(jié)流速開泵/關(guān)泵模式切換出口單向閥入口單向閥泵頭旁通閥出口過濾器泵面板上的操作按鍵泵的開啟和關(guān)閉增加流量減小流量最大流速?zèng)_洗泵，禁用。流速，壓力，高壓，低壓限制的設(shè)定切換泵頭演示圖泵頭剖面圖 泵 進(jìn)樣器進(jìn)樣器 色譜柱（

9、柱溫箱） 檢測(cè)器 工作站 柱后衍生裝置手動(dòng)進(jìn)樣器 泵 進(jìn)樣器 色譜柱色譜柱 檢測(cè)器 工作站 柱后衍生裝置色譜柱固定相分子結(jié)構(gòu)色譜柱類型 泵 進(jìn)樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測(cè)器檢測(cè)器 工作站 柱后衍生裝置201+檢測(cè)器操作界面201+檢測(cè)器的菜單vSIGNAL 菜單v vsignal: 0.0000v:254 t:0.2 ONvv信號(hào)菜單或主菜單包涵信號(hào)強(qiáng)度signal:, 波長(zhǎng) :, 時(shí)間常數(shù)t: 和燈的狀態(tài)。v實(shí)際測(cè)量的信號(hào)值顯示為一個(gè)帶四位小數(shù)的數(shù)字。測(cè)量波長(zhǎng): 可以在 190 至 740 納米區(qū)間，變動(dòng)精度為一個(gè)納米。v使用時(shí)間常數(shù)t: 您可以使信號(hào)更平滑。它的值可以被設(shè)置為0.1, 0.

10、2, 0.5, 1, 2, 5, 或10 秒. 這個(gè)值設(shè)置得越大，信號(hào)就越平滑。時(shí)間常數(shù)為1秒時(shí)一般是作分析時(shí)的最佳值。v最后您可以在這個(gè)菜單開關(guān)燈，分別用ON和 OFF 按鈕。201+檢測(cè)器的菜單vUNITS菜單vvUNITS signal: auv :nm t:sv v這個(gè)菜單僅作信息顯示用，不能改變。顯示的是信號(hào)菜單中各個(gè)值的單位。201+檢測(cè)器的菜單vSCAN 菜單vvSCAN: 620-740 -Fvgo AZ speed:0Hz vv您可以在停止流通模式作掃描。有四種掃描速率供選擇。掃描范圍可以設(shè)置，此前可以先自動(dòng)歸零。截止濾波器可以啟用(+F) 或無效 (-F). 201+檢測(cè)器

11、的菜單vPROG 菜單 vvPROG 000.00-254 vgo 000.00-vvPROG菜單可以輸入一個(gè)可以改變波長(zhǎng)的時(shí)序程序。 如何輸入和執(zhí)行一個(gè)程序的方法將在“輸入一個(gè)程序”部分詳述。程序包括起始和結(jié)束行最多可以包括11行。201+檢測(cè)器的菜單vINT菜單 vv這個(gè)菜單僅作信息顯示用，不能改變。v vINT sig:0.6543 v1/8 ref:0.3848v vsig 和 ref的值分別記錄信號(hào)的強(qiáng)度和參比信道。sig 和 ref值的范圍在0和1之間。它們依賴于所選的波長(zhǎng)，使用的溶劑、流通池和燈的使用年限。兩者值的比率應(yīng)該在1:1.5和1:1.8之間。 如出入較大則說明有可能流通

12、池臟了或者是溶劑在所選波長(zhǎng)處吸收過強(qiáng)。201+檢測(cè)器的菜單vEXT. CONTROL菜單vvEXT. CONTROL:v keyboardv v此菜單可選擇控制模式，外部?jī)x器(external control = analog)或單機(jī)模式（選擇鍵盤）。201+檢測(cè)器的菜單vANALOG OUT 菜單vvANALOG OUT: auvfull scale: 1e-0vvANALOG OUT菜單是用來標(biāo)定模擬輸出信號(hào)的。 一般說來最大輸出信號(hào)是1 V. 根據(jù)實(shí)際情況您可以決定對(duì)于這個(gè)信號(hào)的最大值用多大的單位和相應(yīng)的滿量程偏差。可以選擇1e-4, 2e-4, 5e-4, 1e-3, 2e-3, 5e

13、-3, 1e-, 2e-2, 5e-2, 1e-1, 2e-1, 5e-1, 1e-0, 2e-0, 5e-0 或 1e+1 單位 (分別對(duì)應(yīng)于 0.0001, 0.0002, 0.0005, 0.001, 0,002 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 和 10)。201+檢測(cè)器的菜單vLAMP 菜單vvLAMP: v Deuteriumv這個(gè)菜單用于輸入適用于軟件的燈的類型。選項(xiàng)有氘燈（Deuterium）和鹵（Halogen）燈。 v如果確實(shí)更換了燈的類型，設(shè)置才可以改變。如果設(shè)置和實(shí)際裝備不符，儀器將無法正確地工作。201+

14、檢測(cè)器的菜單v-RANGE/FILTER菜單 vv-RANGE: 190-740 v ? FILTER:380 vv波長(zhǎng)范圍可以被限制為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。然后在此范圍內(nèi)的選值。大于380納米時(shí)可用一邊緣濾波器來增大選擇性。在這種情況下要注意靈敏度的降低問題。201+檢測(cè)器的菜單vA-IN 菜單v vA-IN Set-Zero v actual 000nm v vA-IN-(Analog-IN) 菜單是用來調(diào)整模擬輸入的。使Set-Zero 有效意味著輸入端的電壓信號(hào)為000納米。例如當(dāng)在輸入施以一5V電壓時(shí)，actual欄將顯示500nm作為波長(zhǎng)值。 假設(shè)1V = 100 nm, 500 nm. 生成

15、另一個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，可用波長(zhǎng) 或 鍵改變波長(zhǎng)值。201+檢測(cè)器的菜單vGLP菜單vvGLP S/N:00047755 v01 00962.Oh 101vvGLP菜單包涵了下列信息： 序列號(hào)，所用燈的總數(shù)，當(dāng)前燈的總工作時(shí)間和啟動(dòng)燈的數(shù)量。 泵 進(jìn)樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測(cè)器 工作站工作站 柱后衍生裝置工作站界面圖采集步驟設(shè)定方法打開工作站在主界面中設(shè)置 “譜圖采集參數(shù)”- “采集時(shí)間選項(xiàng)此選項(xiàng)設(shè)置要與自動(dòng)自樣器保持一致。開啟自動(dòng)進(jìn)樣程序數(shù)據(jù)處理-打開譜圖1. 打開標(biāo)樣譜圖點(diǎn)擊文件-打開命令在彈出的對(duì)話框中選擇標(biāo)樣的譜圖文件 數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù)1. 在打開的譜圖最前端點(diǎn)擊右鍵 。在彈出的對(duì)話框中

16、選”自動(dòng)生成譜圖處理表項(xiàng)”-“開始禁止判峰（刪除起點(diǎn)）“數(shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù)1. 在我們需要的峰的前面點(diǎn)擊自動(dòng)生成譜圖處理表項(xiàng)-開始”峰分離處理（谷點(diǎn)改終點(diǎn)）“自動(dòng)判峰積分?jǐn)?shù)據(jù)處理-設(shè)定積分參數(shù)v。完成時(shí)，我們所需要的峰已積分。譜圖處理表項(xiàng)中已自動(dòng)填入?yún)?shù)。數(shù)據(jù)處理-設(shè)定組分表1. 在峰的內(nèi)部點(diǎn)面擊右鍵選擇“自動(dòng)填寫定量組份表中時(shí)間-套峰時(shí)間2. 此時(shí)套峰時(shí)間中會(huì)自動(dòng)填入峰的保留時(shí)間3. 填入組分名稱，濃度值數(shù)據(jù)處理-定量計(jì)算1. 點(diǎn)擊”定量方法“表項(xiàng)，選擇”計(jì)算校正因子“2.點(diǎn)擊定量計(jì)算按鈕數(shù)據(jù)處理-查看計(jì)算結(jié)果計(jì)算結(jié)果將顯示在上圖中。點(diǎn)擊”當(dāng)前表存檔。即保存了當(dāng)前的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理-制作工

17、作曲線v不斷重復(fù)上述過程，將不同濃度的標(biāo)樣全部處理過后，進(jìn)入存檔。v點(diǎn)擊“定量方法”表項(xiàng),選擇“工作曲線”-計(jì)算按鈕v點(diǎn)擊顯示,即可顯示出工作曲線。數(shù)據(jù)處理-基于工作曲線的樣品含量計(jì)算打開樣品譜圖，積分，設(shè)定組分（按前述方法）選擇多點(diǎn)柆正乘數(shù)1：定容體積乘數(shù)2：稀釋倍數(shù)除數(shù)： 稱樣量輸入完畢后，點(diǎn)擊定量計(jì)算數(shù)據(jù)處理-結(jié)果顯示最終含量在此顯示報(bào)告打印點(diǎn)擊打印機(jī)圖標(biāo)，打印報(bào)告報(bào)告打印-通過word 或是寫字板 泵 進(jìn)樣器 色譜柱（柱溫箱） 檢測(cè)器 工作站 柱后衍生裝置柱后衍生裝置柱后衍生系統(tǒng)PCR 主要應(yīng)用領(lǐng)域主要應(yīng)用領(lǐng)域 氨基甲酸酯 草甘膦 黃曲霉毒素 氨基酸 （OPA） 氨基酸 （Ninhyd

18、rin）小結(jié)： 常用的液相色譜由以上幾部分組成。熟悉每個(gè)組件的功能與作用，能夠幫助我們對(duì)使用中出現(xiàn)的問題進(jìn)行正確的判斷與排查。v常見使用故障及維護(hù)檢查指標(biāo)v每日檢查，記錄：v1. 泵壓力，保留時(shí)間是否穩(wěn)定v2. 峰面積與濃度的比值v每周檢查：v1. 線性v2. 重復(fù)性v3. 標(biāo)準(zhǔn)品有效性壓力過大v1. 是否是剛剛換上流動(dòng)相，未平衡，多等10分鐘看壓力是不是已經(jīng)下降。同時(shí)檢查流動(dòng)相配比是否正確，是否已過濾，混勻。v2. 若壓力一直很穩(wěn)定，停泵，待壓力降下來后，拆下色譜柱與檢測(cè)器聯(lián)接，開泵，看是否有壓力下降，若降到正常范圍之內(nèi)，則可以判斷檢測(cè)池堵塞（給廠家致電）；若沒有下降，此時(shí)要完全拆下柱子，開泵，此時(shí)若沒有壓力，則柱子堵塞，需更換，或此時(shí)仍有200以上的壓力，說明泵出口過濾器堵塞，可以將出口過濾器拆下超聲清洗即可。壓力低，波動(dòng)大v壓力比正常值低，且不穩(wěn)定時(shí)1.仔細(xì)檢查是否有漏液的現(xiàn)象。2. 檢查進(jìn)液管中是否進(jìn)氣泡。2. 單向閥被污染。超聲清洗處理3. 柱塞密封漏液，更換密封面積/濃度比異常檢查