細菌轉(zhuǎn)化實驗原理和操作步驟

1、細菌轉(zhuǎn)化試驗原理和操作步驟轉(zhuǎn)化（ transformation ）是指一段同源或異源的 DNA 轉(zhuǎn)入受體細胞并得到表達的水平基因的轉(zhuǎn)移過程，是現(xiàn)代分子生物學爭辯和基因工程不行缺少的重要技術。關鍵詞：細菌轉(zhuǎn)化細菌轉(zhuǎn)化一 試驗目的 1 以 pGLO 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌為例，學習轉(zhuǎn)化的基本原理及方法。2 驗證 DNA 是遺傳物質(zhì)，加深對中心法則的理解。 二試驗原理 轉(zhuǎn)化（ transformation ）是指一段同源或異源的 DNA 轉(zhuǎn)入受體細胞并得到表達的水平基因的轉(zhuǎn)移過程，是現(xiàn)代分子生物學爭辯和基因工程不行缺少的重要技術。目前常用的轉(zhuǎn)化方法有 CaCl 2 法 ( 化學轉(zhuǎn)化法 ) 和電轉(zhuǎn)化法。本試

2、驗是用 pGLO 細菌轉(zhuǎn)化試劑盒中供應的 pGLO 質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所用方法為 CaCl 2 轉(zhuǎn)化法。pGLO 質(zhì)粒：pGLO 質(zhì)粒上主要含有兩個基因，一個為編碼綠色熒光蛋白 (GFP) 的基因，一個為抗生素氨芐青霉素抗性基因。此外，該質(zhì)粒還整合有一個特殊的參與受體細胞中綠色熒光蛋白表達的基因調(diào)控體系，轉(zhuǎn)化細胞中的綠色熒光蛋白基因只有在培育基中存在阿拉伯糖時才能啟動表達。轉(zhuǎn)化子細胞將在不含阿拉伯糖的培育基上呈白色而在含阿拉伯糖的培育基上顯綠色熒光，這種熒光在長波紫外燈下即可觀看到。三 試驗材料受體菌： E.coli K12 HB101質(zhì)粒： pGLO plasmid轉(zhuǎn)化液（ CaCl2 ）

3、氨芐青霉素（ amp ）阿拉伯糖（ ara ）培育基：固體 LB 、液體 LB接種環(huán)、移液器等四 試驗步驟1. 預備平板： 每組： 1 塊 LB 平板， 2 塊 LB/amp 平板， 1 塊 LB/amp/ara 平板2. 預備感受態(tài)細胞：用 250 l 無菌水或轉(zhuǎn)化液懸浮試劑盒中供應的大腸桿菌菌粉，此即感受態(tài)細胞。3. 活化受體細胞：挑取 1 環(huán) E.coli K12 HB101 菌液，于 LB 培育基上 37 活化 16-24h 。4. 轉(zhuǎn)化： 1） 在兩只無菌離心管上分別標記 +DNA, -DNA 。2） 在上述兩管中分別加入250 l 轉(zhuǎn)化液。3) 快速置于冰上。4） 各挑取活化好的受體菌的一個單菌落，懸浮于兩管轉(zhuǎn)化液中。5） 在標有 +DNA 的管中加入一環(huán)質(zhì)粒 DNA ，而標有 -DNA 的管中不加。6） 將上述兩管于冰上放置 10min 。7） 在預備好的培育基底部如左圖。8 ）兩只小管放入 42 水浴中處理 50 秒，再快速放于冰上 2 min 。9 ）在兩只小管中分別加入 250 l LB- 肉湯。10 ）從 +DNA 小管中分別吸取 100 l 滴加在兩個標有 +DNA 的平板上，從 -DNA 小管中分別吸取 100 l 滴加在兩個標有 -DNA 的平板上。11 ）用無菌接種環(huán)將滴加的液體均勻涂布在平板上。1