微生物限度檢查方法適用性驗(yàn)證方案

1、 微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)方案驗(yàn)證方案組織與實(shí)施微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)工作應(yīng)由質(zhì)量管理部門負(fù)責(zé)組織，質(zhì)量管理部門有關(guān)人員組成驗(yàn)證小組，參與實(shí)施。方案起草部門/職務(wù)簽 名日 期質(zhì)量管理部QC方案審核部門/職務(wù)簽 名日 期質(zhì)量管理部QC經(jīng)理方案批準(zhǔn)部門/職務(wù)批 準(zhǔn) 人批 準(zhǔn) 日 期質(zhì)量管理部質(zhì)量總監(jiān)目 錄一、 概述二、 驗(yàn)證目的和風(fēng)險評估三、 驗(yàn)證內(nèi)容四、方法判定五、再驗(yàn)證周期六、參考文獻(xiàn) 七、結(jié)果評價及結(jié)論 1、概述：微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括需氧菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)及把握菌檢查。當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行需氧菌

2、、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的適用性試驗(yàn)和把握菌檢查方法的適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所接受的方法適合于該產(chǎn)品的需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)的測定和把握菌檢查。依照中國藥典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及把握菌均接受平皿法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。2、試驗(yàn)?zāi)康暮惋L(fēng)險評估：驗(yàn)證目的：確認(rèn)所接受的需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法及把握菌檢查方法適合我公司所生產(chǎn)產(chǎn)品的微生物限度檢查。風(fēng)險評估：項(xiàng)目潛在失效模式失效影響實(shí)行措施未按方案執(zhí)行試驗(yàn)部分項(xiàng)目消滅偏差和漂移直接影響試驗(yàn)結(jié)果的正確性嚴(yán)格執(zhí)行經(jīng)批準(zhǔn)的試驗(yàn)方案試驗(yàn)過程操作不當(dāng)未達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)失敗未嚴(yán)格遵循試驗(yàn)方案規(guī)定3、驗(yàn)證內(nèi)容：3.1、培育基來源：品名批號規(guī)格來源確認(rèn)人： 確

3、認(rèn)日期：3.2、檢查用培育基配制方法：培育基名稱配制方法PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液取本品14.63g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。胰酪大豆胨瓊脂培育基取本品40g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。胰酪大豆胨液體培育基取本品30.0g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。沙氏葡萄糖液體培育基取本品30.0g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。沙氏葡萄糖瓊脂培育基取本品65.0g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。麥康凱瓊脂培育基取本品50.0g，加

4、水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。麥康凱液體培育基取本品35.0，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121，15分鐘滅菌，備用。確認(rèn)人： 確認(rèn)日期：3.3、使用儀器 名稱型號校驗(yàn)單位有效期至數(shù)顯電熱恒溫培育箱數(shù)顯霉菌培育箱確認(rèn)人: 確認(rèn)日期：3.4、驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種：菌種名稱代號傳代代數(shù)來源金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌確認(rèn)人： 確認(rèn)日期：3.5試驗(yàn)方法：取供試品10 ml加PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml1:10供試液。需氧菌、霉菌和酵母菌、把握菌接受常規(guī)法。3.6菌液的制備：3.6.1取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸

5、埃希菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培物一鉑金餌，加入胰酪大豆胨液體培育基中置30 35培育箱中培育1824h，取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培育物1ml加入9ml0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至107， 分取各菌懸液1ml注入平皿中，馬上傾注胰酪大豆胨瓊脂培育基20ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培育計數(shù)，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液備用。3.6.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培育物，加入沙氏葡萄糖液體培育基中置2025培育箱中培育2448h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培育物1ml

6、加入9ml0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至107，取菌懸液1ml注入平皿中，馬上傾注沙氏葡萄糖瓊脂培育基25ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培育計數(shù)，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液備用。3.6.3取黑曲霉的新穎培育物接種子沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，20-25培育5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至107，取，取菌懸液1ml注入平皿中，馬上傾注沙氏葡萄糖瓊脂培育基25ml，各菌懸液平行

7、制備兩個平皿，平皿法培育計數(shù)，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液備用。3.7需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法適用性試驗(yàn)： 3.7.1供試液制備： 取供試品10 ml，加PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml1:10供試液。3.7.2試驗(yàn)條件：需氧菌培育溫度：3035 35天 培育箱： 霉菌和酵母菌培育溫度：2025 57天 培育箱： 3.7.3試驗(yàn)方法：3.7.3.1試驗(yàn)組：3.7.3.1.1分別取供試液9.9ml，分別加入0.1ml濃度為1000CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，混勻后取其中1ml注皿,傾注溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂培育基20ml，置3

8、035或培育箱中培育不超過3天，計數(shù)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。3.7.3.1.2分別取供試液9.9ml，分別加入0.1ml濃度為1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液，混勻后分別取其中1ml注皿,傾注溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂培育基20ml，置3035或培育箱中培育不超過5天，計數(shù)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。另分別取其中1ml注皿, 傾注溫度不超過45的沙氏葡萄糖瓊脂培育基20ml，置2025或培育箱中培育不超過5天，計數(shù)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。3.7.3.2菌液對比組：分別取稀釋液9.9ml，分別加入0.1ml濃度為1000CFU的菌液，按試驗(yàn)組操作,傾注溫度不超過45的胰酪大

9、豆胨瓊脂培育基和沙氏葡萄糖瓊脂培育基，置與試驗(yàn)組相同條件下培育, 計數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。3.7.3.3供試品對比組：取供試液1ml，傾注溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂培育基和沙氏葡萄糖瓊脂培育基，置與試驗(yàn)組相同條件下培育, 計數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。3.7.4 試驗(yàn)結(jié)果3.7.4.1結(jié)果判定：試驗(yàn)組的菌落數(shù)減去供試品對比組菌落數(shù)的值與菌液對比組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。比值=試驗(yàn)組菌落數(shù)供試品對比組的菌落數(shù)* 對比組菌落數(shù) 3.7.4.2需氧菌計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)：1 供試品批號:菌種類型試驗(yàn)組菌液組供試品對比組比值銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色

10、念珠菌黑曲霉 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：試驗(yàn)次數(shù)：2 供試品批號:菌種類型試驗(yàn)組菌液組供試品對比組比值銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：試驗(yàn)次數(shù)：3 供試品批號:菌種類型試驗(yàn)組菌液組供試品對比組比值銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：3.7.4.3霉菌和酵母菌計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)：1 供試品批號:菌種類型試驗(yàn)組菌液組供試品對比組比值白色念珠菌黑曲霉 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：試驗(yàn)次數(shù)：2 供試品批號:菌種類型試驗(yàn)組菌液組供試品對比組比值白色念珠菌黑曲霉 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)

11、核人： 日期試驗(yàn)次數(shù)：3 供試品批號:菌種類型試驗(yàn)組菌液組供試品對比組比值白色念珠菌黑曲霉 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期3.7.5結(jié)論:檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期： 3.8把握菌微生物檢測方法適用性試驗(yàn)： 3.8.1試驗(yàn)方法：3.8.1.1試驗(yàn)組：取供試液10ml及不大于100cfu大腸埃希菌菌液加入胰酪大豆胨液體培育基中，置3035培育18-24小時, 取上述培育物1ml接種至100ml麥康凱液體培育基中，4244培育24-48小時。取麥康凱液體培育物劃線接種于麥康凱瓊脂培育基平板上3035培育18-72小時。試驗(yàn)組應(yīng)生長良好。3.8.1.2陰性對比組： 取稀釋劑10ml,加入胰酪大豆

12、胨液體培育基中，置3035培育18-24小時，陰性對比應(yīng)無菌生長。3.8.1.3陽性對比組：取不大于100cfu大腸埃希菌菌液加入胰酪大豆胨液體培育基中，置3035培育18-24小時, 取上述培育物1ml接種至100ml麥康凱液體培育基中，4244培育24-48小時。取麥康凱液體培育物劃線接種于麥康凱瓊脂培育基平板上3035培育18-72小時。陽性對比組應(yīng)生長良好。3.8.2 試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)次數(shù)：1 供試品批號:把握菌項(xiàng)目常規(guī)法大腸埃希菌試驗(yàn)組陽性對比組陰性對比組 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：試驗(yàn)次數(shù)：2 供試品批號:把握菌項(xiàng)目常規(guī)法大腸埃希菌試驗(yàn)組陽性對比組陰性對比組 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：試驗(yàn)次數(shù)：3 供試品批號:把握菌項(xiàng)目常規(guī)法大腸埃希菌試驗(yàn)組陽性對比組陰性對比組3.8.3結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 日期：復(fù)核人： 日期：4. 方法判定：本品按中國藥典20