淺論二 ■ 英對(duì)小鼠異位子宮內(nèi)膜影響的分子機(jī)制研究

1、淺論二 英對(duì)小鼠異位子宮內(nèi)膜影響的分子機(jī)制研究         【摘要】  【目的】 探討四氯二苯并二 英(TCDD)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的影響及其分子學(xué)機(jī)制。 【方法】 采用小鼠自體子宮內(nèi)膜移植法建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，分別給予TCDD 0、l、3、10 g/kg劑量灌胃，每21 d 1次，于建模術(shù)后3、6、9周處死，鑒定異位病灶的形成，測(cè)量異位病灶體積。采用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)各組小鼠異位子宮內(nèi)膜組織中芳香烴受體(AhR)和細(xì)胞色素P450 1A1(CYP1A1)表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】

2、染毒組小鼠異位病灶體積的增加與染毒劑量和時(shí)間具有明顯的正相關(guān)性(r = 為0.727、0.553，均P 0.05);染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜AhR蛋白較對(duì)照組增強(qiáng)(P 0.05);且隨染毒劑量增加和染毒時(shí)間延長(zhǎng)，AhR蛋白表達(dá)相應(yīng)增加(r分別為0.687、0.442，均P 0.01);隨染毒劑量增加，CYP1A1蛋白表達(dá)相應(yīng)增加(r = 0.640，P 0.01)，對(duì)照組未檢測(cè)到CYP1A1蛋白表達(dá);染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜AhR mRNA較對(duì)照組增強(qiáng)(P 0.05)。隨染毒劑量增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，AhR mRNA表達(dá)相應(yīng)增加(r分別為0.565、0.635，P 0.01);隨染毒劑量的增加，CY

3、P1A1 mRNA表達(dá)明顯增加(r = 0.659，P 0.01)，對(duì)照組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中未檢測(cè)到CYP1A1mRNA?！窘Y(jié)論】 TCDD可促進(jìn)小鼠模型異位子宮內(nèi)膜病灶的發(fā)展，其機(jī)制可能與AhR及其下游基因CYP1A1激活有關(guān)。AhR及CYP1A1的表達(dá)增強(qiáng)是二 英暴露的生化指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】  四氯二苯并二 英; 子宮內(nèi)膜異位癥; 小鼠; AhR; CYP1A1Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) on development

4、of endometriosis in a mouse model from perspective of molecular mechanism. 【Methods】 The endometriosis mouse model was established with autotransplantation of endometrium. Twenty-one days prior to induction surgery which produces endometriosis， female mice were pretreated with 2，3，7，8-tetrachlorodib

5、enzo-p-dioxin (TCDD) at 0， 3， or 10 mg TCDD/kg. Animals were treated again at the time of surgery and at 3， 6， and 9 weeks following surgery. Evaluation of ectopic focuses diameter were made at 3， 6， 9 weeks post surgery. The AhR and CYP1A1 expression on ectopic endometrium were identified by immuno

6、histochemistry and RT-PCR assays. 【Results】 With increased time and dose of TCDD exposure， it produced a dose-dependent increase in endometriotic site diameter when all time points were pooled within each dose in mice (r = 0.727 and 0.553 respectively， both P 0.05). The expression of AhR protein on

7、ectopic focuses in mice were higher in the TCDD exposure group than those in control group， and presented time-dose dependent increase (r = 0.687 and 0.442， both P 0.01). The higher dose of exposure increased， the higher CYP1A1 protein expressions enhanced (r = 0.640， P 0.01). As compared with the c

8、ontrol group， the expression of AhR mRNA in ectopic focuses of mice were higher in the TCDD exposure group， and show time-dose dependent increase (r = 0.565 and 0.635， both P 0.01). The higher dose of exposure increased， the higher CYP1A1 mRNA expression enhanced (r = 0.659， P 0.01). 【Conclusion】 TC

9、DD can promote progression of ectopic focus of endometriosis in the mouse 子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是育齡婦女的常見(jiàn)病，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)二英(dioxin)污染越嚴(yán)重的國(guó)家或地區(qū)，其EMS的發(fā)病率越高1。所以，推測(cè)涉及外來(lái)物解毒的酶活性的改變可能是EMS的危險(xiǎn)因素。毒理研究發(fā)現(xiàn)二英通過(guò)與芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)結(jié)合并激活A(yù)hR介導(dǎo)的信號(hào)途徑，發(fā)揮不同毒性效應(yīng)。細(xì)胞色素P450 1A1(Cytochrome P450 1A

10、1，CYP1A1)屬重要的I相解毒酶，是目前研究最多的AhR反應(yīng)基因，報(bào)道稱(chēng)其基因多態(tài)性可能與子宮內(nèi)膜異位癥的形成密切相關(guān)。本文選擇二英中最具代表性的2，3，7，8-四氯二苯并-對(duì)-二英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)為研究對(duì)象，探討在EMS模型中不同劑量及時(shí)間TCDD作用模式下TCDD樣配體AhR及其下游活性物質(zhì)CYP1A1的基因表達(dá)狀態(tài)，探尋TCDD在EMS中可能涉及的分子水平作用機(jī)制。1 材料和方法1.1 動(dòng)物建模參考1996年Cummings的嚙齒類(lèi)動(dòng)物TCDD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ浇?-5，60只成熟未孕SPF級(jí)ICR雌性小鼠(體質(zhì)量為28 3

11、2 g，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為3個(gè)時(shí)間組(3周組、6周組、9周組)，每組20只，每組再隨機(jī)分成4個(gè)TCDD(標(biāo)準(zhǔn)品純度 99%，購(gòu)自Cerilliant公司)劑量組(每組5只)，其分別為對(duì)照組(0 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，中劑量組(3 g/kg)和高劑量組(10 g/kg)。通過(guò)灌胃法染毒，每21 d給藥1次，首次給藥時(shí)間記為0 d，在給藥的第21天，再次給藥同時(shí)行小鼠自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)，自一側(cè)子宮角取約2 mm × 1 mm組織2塊，分別縫合在小鼠腹膜、卵巢。分別在術(shù)后3、6、9周采用脫臼法依次處死各組小鼠，3周組小鼠共暴露TCDD 2次;6周組小鼠共暴露

12、TCDD 3次;9周組小鼠共暴露TCDD 4次。1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)AhR(PRT 9)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)和CYP1A1(B-4)單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)分別作為一抗。石蠟切片，采用SP法，染色步驟按試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)內(nèi)說(shuō)明進(jìn)行，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色。用已知陽(yáng)性的小鼠胎盤(pán)組織作陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡下，細(xì)胞胞漿中具有棕褐黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image-Pro plus 4.5 對(duì)AhR及CYP1A1陽(yáng)性部位進(jìn)行原位半定量檢

13、測(cè)，每張切片隨機(jī)選用5個(gè)視野，選取陽(yáng)性部位，測(cè)定累積光密度(integral optical density，IOD)、面積(area)、計(jì)算相對(duì)光密度(相對(duì)IOD = IOD/area)值，而5個(gè)視野的相對(duì)IOD平均值作為該切片的代表值。1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)AhR、CYP1A1和內(nèi)參照物-actin引物應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)，由南京金思特科技有限公司合成，與從Gene Bank下載的mRNA序列核對(duì)無(wú)誤。AhR上游引物：5-TACTCCACTTCAGCCACC-3，下游引物：5-TGTCATGCCACTTTCTCC-3，241 bp;CYP1A1上游引物：5

14、-AGTATTTGGTCGTGTCA GTAG-3，下游引物：5-TCCAGGGAAGAGTTAGGC -3，494 bp;-actin上游引物：5-ATGGATGACGAT ATCGCT-3，下游引物：5-ATGAGGTAGTCTGTCA GGT-3，184 bp。參照Trizol Reagent(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)，采用一步法提取子宮內(nèi)膜異位灶組織的總RNA。RT-PCR參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa RNA PCR kit (AMV) ver3.0 (大連寶生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增條件：94 預(yù)變性2 min;94 變性30 s，47 退火30 s，72 延伸3

15、0 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)攝影，掃描PCR產(chǎn)物溴乙錠染色后強(qiáng)度，分別行定性及半定量檢測(cè)。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以x ± s表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD(Least-significant difference)法進(jìn)行組間比較，多個(gè)變量之間相關(guān)性用皮爾遜相關(guān)分析(Pearson correlation test)，P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 TCDD對(duì)EMS小鼠的影響建模術(shù)后3周開(kāi)腹鑒定異位病灶的形成，對(duì)照組(n = 5)和染毒組(n = 15)小鼠的

16、卵巢和腹壁種植處均建模成功，形成典型的異位病灶。Pearson相關(guān)分析顯示，染毒時(shí)間和劑量與異位病灶面積的增長(zhǎng)呈明顯的正相關(guān)(r分別為0.727、0.553，均P 0.01)。對(duì)照組成模小鼠的異位種植灶在不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后3、6、9周)，其外觀大體一致。2.2 AhR在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達(dá)免疫組化顯示對(duì)照組和染毒組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中均有AhR陽(yáng)性反應(yīng)表達(dá)。AhR蛋白于對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿上，AhR蛋白在染毒組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞的胞漿均有表達(dá)，主要位于基質(zhì)細(xì)胞胞漿(圖1)。AhR蛋白在染毒組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中表達(dá)增強(qiáng)，和對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.

17、05)。6周和9周時(shí)，不同染毒劑量組AhR蛋白表達(dá)差異明顯(P 0.05);隨著染毒劑量的增加和染毒時(shí)間延長(zhǎng)，AhR蛋白表達(dá)也相應(yīng)增加(r分別為0.687、0.442，均P 0.01;表1)。         2.3 CYP1A1在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達(dá)CYP1A1蛋白位于染毒組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿，高劑量染毒組CYP1A1蛋白表達(dá)明顯增加，和低劑量染毒組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。隨染毒劑量增加，CYP1A1蛋白表達(dá)相應(yīng)增加(r = 0.640，P 0.01)，染毒時(shí)間延長(zhǎng)和CYP1A1

18、蛋白表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r = 0.038，P 0.01)，對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶上未檢測(cè)到CYP1A1蛋白表達(dá)(圖2，表2)。2.4 AhR mRNA在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中表達(dá)染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中AhR mRNA表達(dá)明顯增加，和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)，6周和9周時(shí)，各染毒劑量之間比較，AhR mRNA表達(dá)水平差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。隨染毒劑量增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，AhR mRNA表達(dá)相應(yīng)增加(r分別為0.565、0.635，P 0.01;表3，圖3)。2.5 CYP1A1 mRNA在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達(dá)染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中檢測(cè)到

19、CYP1A1 mRNA表達(dá)，同一時(shí)間組內(nèi)(3，6，9周)不同染毒劑量比較其表達(dá)差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。隨染毒劑量的增加，CYP1A1 mRNA表達(dá)明顯增加(r = 0.659， P 0.01)，暴露時(shí)間的延長(zhǎng)并沒(méi)有增加其mRNA表達(dá)(r = 0.068， P 0.05)，對(duì)照組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中未檢測(cè)到CYP1A1 mRNA。見(jiàn)表4，圖4。3 討 論3.1 TCDD在EMS發(fā)生中的作用近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)EMS發(fā)病率的增高可能與現(xiàn)代環(huán)境污染釋放的環(huán)境毒素有關(guān)，其中毒性最強(qiáng)的環(huán)境毒素二英與EMS之間關(guān)系引起世界廣泛關(guān)注1。比利時(shí)也是世界二英污染較嚴(yán)重的國(guó)家之一，研究發(fā)現(xiàn)

20、比利時(shí)女性血液中二英的毒性當(dāng)量(toxic equivalents，TEQ)明顯高于意大利女性，就比利時(shí)國(guó)家EMS和二英相關(guān)性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，隨著血液中二英TEQ的升高，腹腔EMS和子宮腺肌癥的發(fā)病危險(xiǎn)性也會(huì)相應(yīng)增加，進(jìn)一步證實(shí)了二英可能是EMS發(fā)病的致病因素之一。本實(shí)驗(yàn)EMS小鼠模型研究也證實(shí)了TCDD可促進(jìn)小鼠EMS異位病灶的生長(zhǎng)，且有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。盡管如此，兩者的關(guān)聯(lián)性從動(dòng)物模型至人群流行病學(xué)調(diào)查仍存在爭(zhēng)議9-10。研究結(jié)果的不一致性考慮可能是因?yàn)椴±M和對(duì)照組的篩選標(biāo)準(zhǔn)、研究設(shè)計(jì)及分析方法等不同所導(dǎo)致。因此，二英和EMS的相關(guān)性有待  Porpora MG， Medda

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