晶體表面結合蛋白對草酸鈣晶體生長的抑制作用

1、    晶體表面結合蛋白對草酸鈣晶體生長的抑制作用        摘要為觀察晶體表面結合蛋白(CSBP)對草酸鈣晶體生長的影響，用層析法分離提取正常人和草酸鈣結石病人CSBP，應用種晶體技術檢測CSBP、尿凝血酶原激活肽F1片段(UPTF1)和白蛋白在體外對草酸鈣晶體生長的作用。結果發(fā)現正常人CSBP和UPTF1能顯著抑制草酸鈣晶體的生長，結石病人CSBP的抑制活性低于正常人。提示病人CSBP中UPTF1減少致抑制活性降低與結石形成有關。關鍵詞尿結石草酸鈣 

2、0;   In vitro inhibition of calcium oxalate crystal growth by crystal surface binding proteinsZhu Shaoxing,Zhang Yongshang,Liu Jihong,et al.Department of Urology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030AbstractCrystal surface binding proteins(CSBP) were isolated by chromatogr

3、aphy.The effects of proteins on calcium oxalate crystal growth in vitro were tested using a seeded crystallization technique.It was observed that CSBP and urinary prothrombin F1(UPTF1) of normal subjects could apparently inhibit calcium oxalate crystal growth.CSBP of stone formers showed lower inhib

4、itory activity than that of normal.The inhibitory activity of albumin,whether in normal subjects or in stone formers,was weak.It was concluded that UPTF1 is a potent inhibitor of calcium oxalate crystal growth.A dificiency of UPTF1 in CSBP of stone formers may be related to calculogenesis.Key wordsU

5、rinary calculiCalcium oxalate     本課題為國家教委資助課題作者單位：430030 武漢，同濟醫(yī)科大學附屬同濟醫(yī)院泌尿外科(朱紹興現在福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科)新鮮草酸鈣晶體表面結合物質(CSBS)主要由蛋白質和葡胺聚糖兩類物質組成，有關它們在結石形成初始階段的作用是近年來人們關注的問題之一1，2。我們觀察了其中的蛋白質組分在體外對草酸鈣晶體生長的抑制作用，并對正常人和結石病人蛋白質的抑制活性加以比較。報告如下。 材料與方法一、草酸鈣晶體表面結合物質的制備收集8例正常男性(2435歲)和8例男性草酸鈣結石病人(28

6、43歲)尿液，按文獻方法制備晶體表面結合物質3。二、晶體表面結合物質中蛋白質的分離DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析法分離CSBS中的蛋白質和葡胺聚糖，羥基磷灰石吸附層析法進一步分離蛋白質的各個組成部分4。三、晶體表面結合蛋白對草酸鈣晶體生長體外抑制活性的測定取pH6.5的Tris緩沖液48ml，置37恒溫結晶器內，加0.03mol/L CaCl2和0.03mol/L Na2C2O4各1ml?；靹虻?.6mol/L的草酸鈣亞穩(wěn)過飽和溶液50ml。實驗分四組：A組加CSBP，使蛋白終濃度為10mg/L；B組加白蛋白，蛋白濃度10mg/L；C組加正常人尿凝血酶原激活肽F1片段(U

7、PTF1)，使蛋白終濃度分別為0.06、0.12、0.25、0.50和1.00mol/L；D組加等量雙蒸水為對照。10分鐘后取樣3ml經0.22m微孔濾膜過濾于試管中。加一水草酸鈣籽晶0.5ml(5mg/ml)，攪拌30秒后孵化3小時，各取樣3ml過濾于試管中。原子吸收分光光度計測濾液中Ca的吸光度(A)，按下式計算各蛋白質組分對草酸鈣晶體生長的抑制指數(I.I)。I.I=(1-(AoAt)/(AoAc)×100%上式中Ao為加籽晶前濾液中Ca+的吸光度；Ac、At分別為對照組和實驗組加籽晶孵育后濾液中Ca的吸光度。結果一、蛋白質層析分離結果CSBS中主要含蛋白質和葡胺聚糖兩類大分子

8、物質；正常人CSBP含UPTF1和白蛋白；病人的CSBP以白蛋白為主，UPTF1含量明顯低于正常人。二、各組分對草酸鈣晶體生長的抑制活性正常人和結石病人CSBP的抑制指數分別為42.3%和19.2%，有顯著性差異；白蛋白的抑制活性較低，分別為15.4%和11.5%。正常人UPTF1的作用呈劑量依賴性，UPTF濃度為0.06、0.12、0.25、0.50和1.00mg/L時，其I.I值依次為11.5%、15.4%、23.1%、42.3%和53.8%。討論基質約占草酸鈣結石干重的2%6%，其中可溶成分僅25%左右?；|提取過程，老化、結石生長過程中尿液大分子物質組成的變化等均可影響基質化合物的組成

9、和分子結構。為了避免上述因素的干擾，采用草酸鈣過飽和結晶法制備新鮮晶體表面結合物質，研究結石形成初始階段基質的組成成分及其對成石的作用，發(fā)現尿液中的凝血酶原激活肽F1片段和葡胺聚糖等物質能選擇性地結合到草酸鈣晶體表面4，5。本實驗結果與報道結果類似，不同之處在于除UPTF1外，晶體表面結合物質中還含有較多白蛋白。造成這種差異的原因可能是本實驗中所采用的孵化時間較長，使白蛋白有充分的時間吸附到晶體表面。UPTF1通過-羧基谷氨酸殘基與鈣離子的作用快速結合到含鈣晶體上，白蛋白則以較緩慢的物理方式與晶體結合。尿液大分子物質是結石基質的組分或重要前體，它可通過誘導和促進異質成核，提供晶體生長和聚集的模

10、板，覆蓋晶體表面防止重新溶解等作用而促進結石形成。也可封閉晶體表面活性生長位點或改變晶體表面電荷與能量分布，抑制結晶的生長和聚集。Koide等1認為晶體表面結合物質是草酸鈣結晶生長和聚集的抑制因子；Ryall等5將晶體表面結合物質進一步純化、分離后發(fā)現，其主要組分蛋白質和葡胺聚糖均可抑制草酸鈣晶體的生長和聚集，其中所含的UPTF作用最強。同位素示蹤和掃描電鏡觀察證實UPTF通過結合到晶體表面而發(fā)揮抑制作用。白蛋白是尿液中含量最多的血清蛋白質，能抑制草酸鈣晶體的成核和聚集，對晶體生長的抑制活性很低6。本實驗結果顯示，CSBP、UPTF1和白蛋白均能在體外抑制草酸鈣結晶生長，UPTF1作用最強，其

11、抑制活性呈劑量依賴性，白蛋白抑制作用較弱。說明UPTF1的作用構成CSBP抑制活性的主體，提示UPTF1可能在影響結石形成方面占有比較重要的地位。Drach等7報道結石病人尿液抑制活性低下，其中促進結晶生長聚集作用的高、中分子量蛋白質含量高于正常人，而主要起抑制作用的低分子量蛋白質含量減少；進一步研究發(fā)現，結石病人尿中腎鈣素、TH蛋白等抑制物的分子結構發(fā)生改變，對草酸鈣晶體生長和聚集的抑制作用也相應降低8，9。推測尿液大分子物質組成和功能的變異與結石形成有關。本實驗結果支持這種推測，結石病人CSBP的抑制活性低于正常人，白蛋白的作用與正常人相似。分析CSBP的組成后，我們認為UPTF1缺乏是導

12、致病人CSBP抑制活性低下的重要原因。應用外源性葡胺聚糖類物質防治泌尿系結石已取得一定進展10，11?？梢灶A計，對尿液中蛋白質類大分子物質的研究除了有助于更清楚地認識尿石癥的發(fā)病機制外，還能為臨床上尋找有效的結石防治方法提供理論依據和指導方向。參考文獻1Koide T,Yoshioka T,Yamaguchi S,et al.Urinary crystal surface binding substances on calcium oxalate crystals.Urol Res,1990,18387-392.2Doyle IR,Marshall VR,Dauson CJ,et al.Cal

13、cium oxalate crystal matrix extract:the most potent macromolecular inhibition of crystal growth and aggregation yet tested in undiluted human urine in vitro.Urol Res,1995,2353-62.3Morse RM,Resnick MI.A new approach to the study of urinary macromolecules as a participant in calcium oxaltae crystalliz

14、ation. J Urol,1988,139869-873.4劉繼紅，章詠裳，吉岡俊照，等.尿草酸鈣晶體表面結合物質蛋白質的分離和初步鑒定.中華泌尿外科雜志，1995，16579-582.5Ryall RL,Grover PK,Stapleton AMF,et al.The urinary F1 activation peptide of human prothrombin is a potent inhibitor of calcium oxalate crystallization in undiluted human urine in vitro.Clin Sci,1995,89505-

15、541.6Worcester EM,Nakagawa Y,Wabner CL,et al.Crystal absorption and growth slowing by nephrocalcin,albium,and tamm-horsfall protein.Bio Chem,1988,225F1197-F1205.7Drach GW,Kraljevich Z,Randolph AD.Effects of high molecular weight urinary macromolecules on crystallization of calcium oxalate dihydrate.J Urol,1982,127805-810.8辛殿旗，馮陶，竇長琪，等.正常人和結石病人尿中不同分子量的分離物對草酸鈣晶體的影響.中華實驗外科雜志，1994，11343-344.9Coe FL,Nakagawa Y,Parks JH.Inhibitors within the nephron.Am J Kidney Disease,1991,17407-413.10張石