微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量實驗報告

1、微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量試驗報告一、試驗目的1.學習微量凱氏定氮法的原理2.把握微量凱氏定氮法的操作技術（未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計算等）二、試驗原理凱氏定氮法常用于測定自然有機物（如蛋白質(zhì)，核酸及氨基酸等）的含氮量。當自然含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫被氧化成二氧化碳和水，而氮則變成氨并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程稱為“消化”。此過程進行的相對較為緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高溶液的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。氧化劑過氧化氫也能加速反應。消化過程：蒸餾：在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣。反應方程

2、式如下：吸取與滴定：蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進行吸取，待吸取完全后，再用鹽酸標準溶液滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止（即滴定至藍紫色)，最終依據(jù)所用標準酸的當量數(shù)（相當于待測物中氨的當量數(shù)）計算出待測物中的氮量。三、試驗試劑、材料和器材試驗材料：食用面粉。試驗試劑：濃硫酸、30%氫氧化鈉溶液、克氏催化劑、2%硼酸、指示劑、0.01M HCL。試驗器材：凱氏燒瓶、電爐、凱氏定氮蒸餾裝置、錐形瓶、100ml容量瓶、酸式滴定管。四、操作步驟1.消化（1）精確稱取1克食用面粉，用稱量紙卷好當心送入至50毫升的凱氏燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上；（2）向另一燒瓶加入1ml水作空白對比；在每個燒

3、瓶內(nèi)加入硫酸鉀硫酸銅混合物（克氏催化劑）少許，濃硫酸10ml，小瓷片兩粒，搖勻；（3）將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，在通風廚內(nèi)的電爐上消化；（4）在消化開頭時，應把握火力，不要使液體沖到瓶頸；（5）待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開頭分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，連續(xù)消化，直至消化液呈透亮綠色為止；（6）消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10ml（留意慢加，邊加邊搖）；（7）冷卻后將瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)入100ml的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最終定容至刻度搖勻，做上記號備用。2.蒸餾（1）蒸餾器洗凈后，開放水龍頭P3，使水進入A室，水放至A室球部2/3處即

4、可。（2）取3個50ml的錐形瓶，分別加入10ml硼酸（內(nèi)加有混合指示劑）。用表面皿復蓋備用。（3）加樣 用移液管吸取2ml消化液，當心地由漏斗D傾入B室； 取一個盛有硼酸的錐形瓶，置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液，用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉5ml，隨即將P4夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉。（4）蒸餾 用酒精燈加熱，維持火力恒定，沸騰不行高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱F頂端滴下時起，連續(xù)蒸餾5分鐘； 然后將錐形瓶放低，使導管離開液面再蒸2分鐘，最終用蒸餾水洗導管外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶預備滴定。（5）空白蒸餾 用移液管分別吸取2ml蒸餾水按上述操作步驟進行

5、蒸餾。LH儀器的洗滌：3.滴定（1）蒸餾完畢，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 鹽酸標準溶液進行滴定錐瓶內(nèi)溶液，溶液由藍綠色變?yōu)榈仙蚧疑?，即為終點。（2）記錄所用鹽酸的量。4.計算若測定的樣品含氮量部分只是蛋白質(zhì)則：式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)； B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)； C為稱量樣品的克數(shù)：0.0100為鹽酸的當量濃度（實際上，此項應按試驗中使用鹽酸的實際濃度填寫）；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)（1毫升0.1N鹽酸相當于0.14毫克氮）。五、試驗結果序號稱量樣品(g）滴定樣品用去的鹽酸（ml）滴定空白用去的鹽酸（ml）1115.2 0.122115.4若測定

6、的樣品含氮量部分只是蛋白質(zhì)，則：式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)； B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)； C為稱量樣品的克數(shù)：0.0100為鹽酸的當量濃度（實際上，此項應按試驗中使用鹽酸的實際濃度填寫）；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)（1毫升0.1N鹽酸相當于0.14毫克氮）。六、留意事項1.本法適用于0.05-3.0mg氮，樣品中含氮量過高時，則應削減取樣量或?qū)右合♂尅?.勿使樣品粘于燒瓶頸部。放置液體樣品時，需將吸管插至燒瓶底部再放樣：如固體樣品，可將樣品卷在紙內(nèi)，平插入燒瓶底部，然后再將燒瓶直起，紙卷內(nèi)的樣品即完全放在燒瓶底部。3.蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，連續(xù)蒸餾1min

7、，將附著在尖端的吸取液完全洗入吸取瓶內(nèi)，再將吸取瓶移開，最終移開酒精燈，絕不能先滅燈，否則吸取液將發(fā)生倒吸。4.硼酸吸取液的溫度不應超過40°C，否則氨吸取減弱，造成損失，可置于冷水浴中?；旌现甘緞┰趬A性溶液中呈蘭綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。七、思考題1.寫出一下各步的化學反應方程式:蛋白質(zhì)的消化、氨的蒸餾、氨的滴定。答：蛋白質(zhì)的消化: 氨的蒸餾： 氨的滴定： 2.指出本測定方法產(chǎn)生誤差的緣由答：在消化過程中，消化時間，催化劑，濃硫酸都要一樣，肯定要消化完全。在消化過程中蛋白質(zhì)附著在凱氏燒瓶壁上沒有被消化也會影響最終的濃度。蒸餾過程中，蒸餾出來的液體量肯定要相同，由

8、于不一樣的蒸餾水，最終結果不一樣，在蒸餾的過程中一開頭要加入買的蒸餾水，蒸餾過程中加入的是自己用自來水蒸餾的。蒸餾中出氣孔的管子肯定要插入硼酸液面以下，蒸餾過程中保證冷凝水始終在流淌。蒸餾過程中定氮儀各連接處應使玻璃對玻璃外套橡皮管確定不能漏氣。加入消化液后加氫氧化鈉應當心緩慢加入，開關甲不能常開，加完后加水液封。滴定過程中應一滴一滴加入，滴定速度過快簡潔滴定過量。滴定過程中仰視刻度結果偏小，俯視刻度線結果偏大。蒸餾裝置的洗滌過程中洗滌不潔凈也會導致誤差的消滅。本試驗方法適合測量0.05-3.0mg氮，含量過大應當削減取樣量或者樣液稀釋。否則會產(chǎn)生誤差。3.消化過程中產(chǎn)生何種有毒氣體？如何推斷

9、消化終點？答：可能會產(chǎn)生一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫。消化終點判定：在消化開頭時，應把握火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開頭分解并放出白煙后，適當加強火力，連續(xù)消化，直至消化液呈透亮綠色為止。八、爭辯經(jīng)過本次利用微量凱氏定氮法進行面粉中蛋白質(zhì)的粗測定試驗，使我較為嫻熟的把握了凱氏定氮蒸餾裝置的使用，并且了解了其工作原理，這對于以后的學習是有很大掛念的。經(jīng)查閱資料得，面粉中蛋白質(zhì)的含量或許在9左右，本次試驗的結果為2.66，總體來講，本次試驗較為失敗，沒能夠粗略地測量出了面粉中蛋白質(zhì)的含量。經(jīng)過分析后，得出幾點影響試驗結果的因素，如下：1.在消化過程中，消化時間，催化劑，濃硫酸都要

10、一樣，肯定要消化完全。在消化過程中蛋白質(zhì)附著在凱氏燒瓶壁上沒有被消化也會影響最終的濃度；2.蒸餾過程中，蒸餾出來的液體量肯定要相同，由于不一樣的蒸餾水，最終結果不一樣，在蒸餾的過程中一開頭要加入買的蒸餾水，蒸餾過程中加入的是自己用自來水蒸餾的。蒸餾中出氣孔的管子肯定要插入硼酸液面以下，蒸餾過程中保證冷凝水始終在流淌。蒸餾過程中定氮儀各連接處應使玻璃對玻璃外套橡皮管確定不能漏氣。加入消化液后加氫氧化鈉應當心緩慢加入，開關甲不能常開，加完后加水液封；3.滴定過程中應一滴一滴加入，滴定速度過快簡潔滴定過量。滴定過程中仰視刻度結果偏小，俯視刻度線結果偏大；4.蒸餾裝置的洗滌過程中洗滌不潔凈也會導致誤差的消滅；5.本試驗方法適合測量0.05-3.0mg氮，含量過大應當削減取樣量或者樣液稀釋。否則會產(chǎn)生誤差；6.用量筒量取溶液時，仰視或俯視讀數(shù)，會導