數(shù)量性狀基因座(QTL)精細定位的研究進展

1、數(shù)量性狀基因座(QTL精細定位的研究進展來源:盧超的日志本文轉(zhuǎn)自博士論壇,希望與大家分享!生物界的許多性狀是以數(shù)量性狀為基礎的,該類性狀的發(fā)生不是決定于一對等位基因,而是受到兩對或更多對等位基因的控制,每對等位基因彼此之間沒有顯性與隱性的區(qū)別,而是共顯性。這些等位基因?qū)υ撨z傳性狀形成的作用微小,所以也稱為微效基因(minor gen e,它們在染色體上的位置稱為數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci, QTL。數(shù)量性狀就是由許多對微效基因的聯(lián)合效應造成的一類具有正態(tài)分布特性的性狀,具有這種性狀的個體在正態(tài)分布中的位置決定于它們所具有的微效基因的多少。數(shù)量性狀之所以復雜,

2、是因為這種性狀與基因型之間沒有一一對應的關系,并且環(huán)境因素對它有顯著的影響1。1961年,Thoday首次利用一對側(cè)翼標記定位一個QTL2,隨后QTL的研究得到飛速發(fā)展?，F(xiàn)已證明,只要是控制連續(xù)分布性狀的數(shù)量性狀基因座,就能在實驗群體或遠交群體中定位3 。在整個QTL的研究中,可分為發(fā)現(xiàn)QTL,QTL的定位估計和精細定位4。Glazier認為可分成四個步驟:連鎖和關聯(lián)分析,精細定位,序列分析和候選基因的功能檢測5。在模式生物小鼠的QTL研究,已描述的實驗步驟更為詳細6:第一,把QTL定位到染色體的區(qū)段上。典型的QTL定位方法須對幾百個雜交后代進行恰當?shù)谋硇蜋z測;利用覆蓋整個基因組的75-100

3、個遺傳標記進行基因組掃描,遺傳標記的平均跨度為15-20個厘摩(cM;準確基因分型,然后對性狀和遺傳標記之間進行連鎖和關聯(lián)分析;計算QTL與某標記位點靠近的可能性大小。這種方法即使經(jīng)過成百上千次的表型和基因型的分析,定位的QTL在染色體上還是一個較大的區(qū)間。第二,把一個QTL的作用與其它QTL的作用分開。通常在同源系(congenic strain中進行,這樣就把多基因遺傳的性狀轉(zhuǎn)化成單基因性狀進行研究。目標QTL與其它有作用的QT L分離后,仍須具有可測量的表型效應,否則達不到分離目的。該方法的局限性在于單個同類系不能分解幾個連鎖在一起的有相同作用的QTL,特別是該性狀是由很多的基因控制的時

4、候。由于不知道單個QTL能否引起一個表型的可測量變化,使得進一步的工作更加困難7, 8。第三,QTL的精細定位。在開展分子水平的研究之前,盡可能把QTL所在的區(qū)間縮短至幾個厘摩,甚至更小的范圍內(nèi)。這就需要大量的染色體片段的重組和可靠的表型測定,解決方法是構(gòu)建一些特殊的實驗群體,并對其中的特殊個體進行后代測試(progeny testing。第四,鑒定和評估候選基因。模式生物基因組測序的完成,提供了該基因的全部序列信息。但是對于QTL已經(jīng)精細定位的遺傳距離還顯得太寬(1 cM 大約含有30個以上的基因。因此在對候選基因進行功能檢測(functional test之前,必須清楚了解每個QTL對表型

5、的影響。第五,證實候選基因。一般用基因打靶或轉(zhuǎn)基因的方法。QTL是在漫長的自然變異中形成的,研究QTL的最大挑戰(zhàn)是要在兩個親本之間精確區(qū)分高度連鎖在一起的多態(tài)性性狀。要證明一個QTL性狀是由某個等位基因引起,必須在主系(host strain中把該等位基因用其它基因替換并觀察效應,這在技術上很困難,而且主系在很多情況下不是一個標準的近交系9 -12。以上幾個步驟在QTL在研究過程中不是截然分開的。由于QTL研究能夠定位基因,因此研究基因間的相互作用和功能,篩選和操縱農(nóng)作物的重要經(jīng)濟性狀,了解進化,為復雜遺傳疾病提供新的診斷和治療方法,在學術界引起了廣泛的研究興趣13。在過去的20年里,已在人類

6、、模式生物、植物中發(fā)現(xiàn)和定位了許多影響復雜性狀的QTL。隨著高通量的基因表達譜分析、新的分子遺傳工具對基因組的操作、比較制圖和復雜的統(tǒng)計軟件的開發(fā),使得QTL的精細定位和位置克隆成為可能。本文將對QTL精細定位的研究進展進行綜述。(一QTL精細定位的基本策略與方法QTL的初步定位在染色體上是一個比較寬的區(qū)間,有必要對此進行精細定位,盡可能地把關鍵區(qū)間縮小,但精細定位難度很大。利用一般群體進行QTL定位時,QTL的可信區(qū)間通常在10 cM以上14,很難確定檢測到的一個主效QTL到底是一個還是包含有多個微效QTL 15。因此,還須構(gòu)建特殊的實驗群體來精細定位QTL。目前設計了多種方法進行QTL的精

7、細定位,如高分辨率的雜交(high-resolution crosses,構(gòu)建同類系(congenic strains,近等基因系(near-isogenic lines,NIL,后代測試(p rogeny testing,連鎖不平衡(linkage disequilibrium ,LD分析,家系研究(family-b ased studies,或是病例-對照研究(case-control studies等5。實驗一開始的低分辨率連鎖分析主要用來發(fā)現(xiàn)QTL,以便進行接下來的精細定位研究,與其相反的是,高分辨率研究的目標是有效縮小侯選區(qū)間的范圍。綜合使用這些方法能把QTL的可信區(qū)間降到1cM 以

8、下16-19。研究QTL精細定位最好的群體是構(gòu)建目標QTL的近等基因系(QTL-NIL。近等基因系的基本特征是整個染色體組的絕大部分區(qū)域完全相同,只在少數(shù)幾個甚至一個區(qū)段存在彼此差異。因此,它能使基因組中只存在一個或幾個QT L分離。這樣做可以消除其她背景干擾和消去主效QTL對微效QTL效應的掩蓋作用,從遺傳上和統(tǒng)計上為QTL定位創(chuàng)造條件。盡管近等基因系構(gòu)建時間長、工作量大,但近等基因系對QTL分解和精細定位的獨特優(yōu)越性使其成為分離和克隆QTL的理想群體。構(gòu)建近等基因系,首先需要對QTL初步定位,再結(jié)合回交和分子標記輔助選擇,對QTL靶區(qū)間進行正選擇,對背景進行負選擇,從而快速構(gòu)建靶區(qū)間的近等

9、基因系。如果創(chuàng)建一套覆蓋全基因組的染色體片段的替代系,將對QTL精細定位提供非常便利的條件。目前在番茄中已建立起這樣的替代系20。DorweiIer等21利用近等基因系把控制玉米主穗差異的基因座TGA1,精確定位成孟德爾基因。Yamamoto等22用連續(xù)回交選育的方法獲得水稻抽穗期近等基因系,其后代的抽穗期分離呈現(xiàn)一對基因的孟德爾遺傳分離規(guī)律,6號染色體上的抽穗期主效QTL(Hd1定位在相距0.6 cM的R1679-P130之間,與C235共分離。Yano等23把一個12kb的基因組序列確定為該QTL的候選基因,并發(fā)現(xiàn)雙親的等位基因序列間存在多種差異,包括堿基替換、一段缺失和一段插入等。應用N

10、ILs和亞NILs(sub-NILs,精細定位了3個番茄遲發(fā)枯萎抗性QTL24。理論研究表明,縮小QTL可信區(qū)間的瓶頸在于研究群體只能提供有限的減數(shù)分裂的信息25, 26。因此,有學者建議應充分利用生物在長期繁育過程中累積起來的標記與QTL之間的重組信息。目前,常聯(lián)合采用連鎖與連鎖不平衡進行QIL的精細定位27(二近交群體中QTL的精細定位能夠方便構(gòu)建近交群體的生物,如水稻28、玉米29、小麥30、果蠅31、酵母32等,使得一些數(shù)量性狀得到了精細定位。本文著重介紹近交小鼠的精細定位。近交小鼠是研究復雜性狀和人類疾病的很好的模型。一個近交系是由經(jīng)過連續(xù)20代以上全同胞或親子交配培育而成的品系,可

11、以認為在整個基因組上所有的遺傳位點都是純合的。只要品系間有差異,就可以利用品系間雜交2代、2代以上以及回交群體中性狀分離的個體進行控制基因位點的確定。利用近交小鼠可構(gòu)建許多精細定位所需的群體。1、以高級互交系(Advanced intercross line, AIL進行QTL的精細定位該策略是Darvasi在1995年提出的33。AIL是由兩個近交系隨機交配產(chǎn)生F1代,F1代個體再隨機互交產(chǎn)生F2代。以同樣的方式產(chǎn)生AIL F3、F4、F5,直到獲得實驗所需的A IL為止。為了增加染色體間重組的概率,在實驗動物的繁殖中應避免同窩間的交配。AIL能進行QTL精細定位的理論基礎是一個群體之間不斷

12、的互交,能減少連鎖不平衡,使得任何連鎖位點之間重組的幾率趨向于0.534。經(jīng)過多代交配以后,精細定位所需的重組事件就會在AIL個體中積累,達到實驗檢出的水平。對AIL群體大小的要求是不少于100只。利用AIL尋找QTL時,因能打破QTL與連鎖標記位點之間的連鎖不平衡,所以可以把幾個連鎖的QTL與一個效應較大的QTL區(qū)別開。QTL定位的精度用可信區(qū)間來表示,與AIL定位精度有關的參數(shù)有染色體的長度,QTL所在區(qū)間相對于染色體末端的距離,標記之間的跨度,實驗群體的大小,QTL效應的大小等33,這和用F2代小鼠定位參數(shù)是一致的35。一些在F2代中提高定位準確性的方法,如Zeng36提出的復合區(qū)間作圖

13、法(CIM,在AI L中也同樣適用。當在一個區(qū)間檢測一個QTL時,CIM方法可利用其它標記作為協(xié)方差控制其它QTL,并且減少了殘余方差,這樣檢測就有所改進,而且AIL能把連鎖在一起的QTL 顯著分開。F2代和回交(back cross,BC小鼠,也能進行QTL的精細定位,但須繁育大量的群體。比如,一個效應為25%的QTL,精細定位至5 cM,利用F2代需4500個個體,而用AIL (F10只需1500個個體33。若繁育個體和表型測定的成本低,或是一些簡單的形態(tài)學性狀,用F2進行精細定位也不失為一種方法。若表型很難測定,或?qū)σ恍碗s的行為進行定位,采用AIL更好。兩個近交系雜交的后代經(jīng)連續(xù)20代

14、以上兄妹交配可形成重組近交系(Recombinant inbred line, RIL,此過程中染色體的重組概率也在不斷增加,一個RIL積累的重組事件與AIL (F4的相同。使用AIL定位QTL的效率,和使用多個RIL是一致的,花費卻只是培育一個RIL的費用。若某個性狀是由少量低遺傳度的QTL決定的話,那么使用RIL更有效,因為RIL更能降低環(huán)境因素的影響33。運用A/JC57BL/6J(F6AIL,Iraqi等人成功精細定位了小鼠三個錐體蟲抗性數(shù)量性狀基因座37,38。Wang等人在C57BL/6JNZB/BlNJ (F11群體精細定位了濃縮高密度脂蛋白(HDL膽固醇的4個QTL39,分別位

15、于1、5和16號染色體上。肺腺癌易感基因1-3 40在(A/JC57BL/6 F(11 AIL中也得到了精細定位。2、選擇性表型測定(Selective phenotyping雖然繁育了大量的F2與BC群體,但只有在原QTL所在區(qū)間發(fā)生染色體重組的個體才用作表型的測定。因為一旦某個QTL定位到某個區(qū)間內(nèi),那么只有在那個區(qū)間內(nèi)發(fā)生重組的個體對精細定位才有意義。任何次數(shù)的重組都會縮小QTL所在的區(qū)間,隨后在更小的區(qū)間內(nèi)尋找新的重組。實驗時,需要測定表型的動物總量會減少,減少量為F2代個體的1/2r(1-r,BC個體的1/r(r 為所研究QTL內(nèi)發(fā)生重組的概率,但繁育的動物總數(shù)與F2和BC的個體數(shù)相

16、同,所以這種方法不常用。3、利用帶有特異片段的同源系(interval-specific congenic strains,ISCS進行精細定位若要對某區(qū)間進行精細定位,須使在該區(qū)段內(nèi)發(fā)生染色體重組的個體與親本反復回交,以減少親本其它QTL對表型的影響。然后,這些個體再互交,選擇具有重組單倍體的純合子確立一個ISCS。雜交的每一步都需要用DNA標記來篩選實驗所需的個體以減少繁育代數(shù)。利用ISCS,Ehringer等人精細定位了小鼠3個與酒精有關的QTL,稱為Znf142, Ptprn和Z nf13341。作者還認為,對ISCS小鼠聯(lián)合使用高通量的序列比較和QTL的精細遺傳圖譜,可以加快從QTL

17、到基因克隆的過程。4、重組后代檢測(Recombinant progeny testing如果個體帶有我們感興趣的重組染色體片段,可以讓它們與親本雜交,把QTL所在的區(qū)間在個體中固定下來。為了把QTL所在的可信區(qū)間由ycM減小為xcM,就必須有y/x個重組個體,每個個體帶有一個寬約y/x的重組區(qū)間,所有個體覆蓋原ycM的范圍。聯(lián)合ISCS和重組后代檢測,把小鼠對酒精和戊巴比妥的撤退依賴性的QTL精細定位至4號染色體小于1cM的區(qū)間內(nèi)42,而在小鼠的體重QTL研究中,把X染色體上的區(qū)間縮小至2cM以內(nèi)43。5、重組近交分離試驗(Recombinant inbred segregation tes

18、t,RISTRIST是十分新穎的實驗設計,充分利用了重組近交系(RI的高分辨率圖譜,并成功運用到QTL的定位中。為了把QTL區(qū)間由ycM減小為xcM,須選擇y/x個RI系,各系在ycM 內(nèi)均發(fā)生重組,所有RI系的重組區(qū)段能覆蓋y cM的區(qū)間。有時,實驗實際所需的RI系數(shù)目比理論的要少,因為一個RI系在感興趣的區(qū)間發(fā)生不止一次的重組。為了產(chǎn)生RIST群體,需P1和P2兩個近交系,以P1,P2交配產(chǎn)生一個RI。選擇一個在感興趣區(qū)段發(fā)生重組的RI與P1、P2交配產(chǎn)生F1代,分別稱為F1.1、F1.2,隨后F1代互交,產(chǎn)生RIST-F2代,稱為F2.1、F2.2。RIST-BC是由P2F1.1,產(chǎn)生B

19、C1,P2F1.2產(chǎn)生B C2。對于加性效應,趨向采用RIST-F2作為研究群體,因為在這種情況下,標記位點上同源基因型會提供更多的信息,并且只對標記位點純合的個體進行表型測定。而當考慮顯性效應時, RIST-BC會更有效。6、HS(heterogeneous stock與整個動物種群相比,近交系所產(chǎn)生群體的遺傳異質(zhì)性顯著減小,那些在野生群中分離的Q TL在近交群體中有可能不分離。為了解決這個難題,Mott44等人構(gòu)建了HS。這是由近交系C57BL, BALB/c, RIII, AKR, DBA/2, I, A和C3H/2按8種方式交配,共形成40個交配對,它們的子代再隨機互交,這樣雜交60代

20、,確保產(chǎn)生的每一代沒有共同的祖父母。這樣HS個體中的每一條染色體都是祖系(founder strains很好的遺傳嵌合體,它們重組的平均距離是1/60 或1.7 cM。HS提供了在8個近交系中尋找任一分離QTL的可能性。通過H S,Mott驗證了原發(fā)現(xiàn)的5個與恐懼有關的QTL。由于HS充分利用了多代交配積累下來的交叉重組,所以經(jīng)過有限數(shù)目的連鎖雜交以后,一個親本的單倍型能夠被縮小至很小的區(qū)段。該理論在小鼠QTL的精細定位中把可信區(qū)間縮小到1cM45,比F2代得到的分辨率要提高30倍33,46。HS研究也存在一些弊端:遺傳異質(zhì)效應對QTL定位的干擾作用;缺乏遺傳背景明確的品系進行隨后的功能研究6

21、;定位的敏感性太高,有可能把QTL標錯47。利用HS群體,Volkman等人成功定位了決定小鼠股骨大小與形狀的QTL48,Galsworthy 等定位了決定小鼠一般認知能力的QTL49。在研究酒精誘導的運動活動中,在D2Mit94 和D2Mit304之間,發(fā)現(xiàn)3個QTLs,它們的分辨率達到2 cM或更小50。7、以敲除(Knock out的方法作為同源系來研究QTL僅僅通過回交的方法是不能消除側(cè)翼基因?qū)λ芯縌TL的影響的。即使回交100代,也只能把QTL區(qū)間縮小至2cM51。2001年Bolivar52等利用近交系129的基因敲除小鼠與C 57BL/6J(B6回交,產(chǎn)生了B6的遺傳背景基礎上

22、帶有129小片段染色體的小鼠。Bolivar比較了帶有129小片段染色體的B6小鼠與該129片段被敲除的B6小鼠(B6.129-KO的表型差異,如果發(fā)現(xiàn)不同,就能把敲除片段的效應從側(cè)翼基因的效應中區(qū)別出來。Jackson實驗室已成功繁育了大量的B6.129-KO系小鼠供實驗用,所以這項技術的應用前景十分廣闊53。以敲除方法產(chǎn)生的同源系,雖然可靠,但仍不能減少對RI、F2或回交群體的需要。聯(lián)合使用一些同源系分析方法,可能省略QTL初始定位的步驟,但有一些缺陷,比如和某個位點具有同向作用的QTL可能不易被發(fā)現(xiàn),也會降低上位效應以及相互作用的其她位點的信息。用B6.129-KO同源系可以定位新的QT

23、L或確定已經(jīng)存在的QTL,但不可能把定位的區(qū)間降到1-2 cM以下,因為同源系帶有的片段本身就有10-20cM。但用這種方法可以加快129B6精細定位和表型相近的QTL的定位。8、基因組標簽小鼠基因組標簽小鼠(genome-tagged mice, GTM是Iakoubova54等描述的。雖然同源系能進行QTL的精細定位,但培育同源系時須不斷與親本回交,然后在每一子代個體中篩選帶有供體染色體片段的小鼠,比較費時。加快這一過程的方法是構(gòu)建一個同源系庫,在其它遺傳背景基礎上構(gòu)建包含有某供體小鼠整個基因組的同源系。通過標記輔助(marker-assis ted技術構(gòu)建了兩套重疊同源系,每套同源系包含

24、有超過60個的小鼠品系。C57BL/6J 作為背景系,而DBA/2J 或CAST/Ei 作為供體系,由于選作背景系和供體系的小鼠在遺傳和表型上差異大,所以用GTM可快速定位表型的遺傳基礎。在復雜行為中,如學習與記憶的QTL等已經(jīng)在GTM中定位至8.8cM的區(qū)間內(nèi)55。9、染色體替代系(chromosome substitution strains, CSSsCSS是通過不斷回交的方法,培育僅有一條染色體和其她近交小鼠不同的近交系56。用來實驗的兩個親本只是某條染色體的不同,其它染色體均相同9。Nadeau報道構(gòu)件建了帶有A/J染色體片段的B6小鼠(B6.A,后來又陸續(xù)構(gòu)建了A.B6,B6.12

25、9,和129.B6等CSS 小鼠。第一個CSSs被成功用來研究睪丸母細胞瘤遺傳易感性的基因定位。因為CSSs有一個基本相同的遺傳背景,所以和分離系相比,作者僅用少量的CSSs群體就得到了很強的連鎖證據(jù)10。一旦CSSs被成功構(gòu)建,不需要進一步的基因分型和雜交,就可以明確QTL是否存在在某條染色體上,而且不受其它分離QTL的影響。CSSs還可以用來繁育同源系(co ngenic strain,比傳統(tǒng)的方法相比,可減少繁育的代數(shù)。用一個CSS與供體系(donor str ain交配來尋找剩余QTL,可以消除固定QTL的混雜影響。若能獲得兩個親本足夠的CSS 嵌合體,則更容易區(qū)別和發(fā)現(xiàn)基因的相互作用

26、。CSS也能進行QTL的功能研究。10、誘導突變利用化學誘變劑,如亞硝基乙基脲(ethylnitrosourea,ENU,可有效的誘導影響表型的單基因發(fā)生突變。ENU誘導的特定基因高頻突變,通常的形式是A:T和G:C之間的顛換57,產(chǎn)生一系列具有表型效應的突變?nèi)后w。以廣譜致突變劑,如EMS 和ICR199等處理胚胎干細胞,可以增強誘導效果58,59。誘導突變時,影響復雜性狀的每個基因都可能是潛在的被誘變對象。相同表型測試法可篩選突變的小鼠,若該方法具有在同源系中發(fā)現(xiàn)一個QTL 的敏感性,那么也能在誘導突變系中檢測影響該性狀的突變基因。誘變實驗成功的關鍵是要有一系列高效、可靠的表型測定來檢測大量

27、的突變小鼠,并且要設計隨后的試驗來確證該表型是被誘導的。誘導突變也有一些局限性:和QTL一樣,一些突變也不容易被發(fā)現(xiàn);由于遺傳背景的影響,在連鎖交配時一些突變也不易被發(fā)覺。由于誘導突變很容易鑒定表型變異的遺傳基礎,發(fā)現(xiàn)單基因突變引起的性狀改變,在QTL研究中可以省略很多繁復的步驟,為尋找基因提供了一條簡單的途徑。在小鼠中進行精細定位,在大鼠中也同樣適用。如利用同源系大鼠對NOD大鼠1型糖尿病的易感基因進行了定位60。在自發(fā)高血壓大鼠(SHR中,通過cDNA點陣、同源性制圖和放射雜交(radiation hybrid ,RH,對胰島素抗性基因進了精細定位61。有學者發(fā)現(xiàn)了同源系大鼠的數(shù)量基因座M

28、cs1內(nèi)三個Copenhagen基因?qū)θ橄侔┑木哂锌剐宰饔?2。(三遠交群體QTL的精細定位在近交系中構(gòu)建暫時性分離群體、永久性分離群體和近等基因系群體進行精細定位的方法,在實驗生物中是可行的,但在人類和大部分家畜中是不切實際的。在這類群體中不僅可以進行非參數(shù)的連鎖分析對復雜性狀進行定位,而且還可充分利用群體在繁衍過程中積累的歷史重組事件,即連鎖不平衡和血緣一致性(identity-by-descent, IBD進行定位63。連鎖分析適合家系資料的研究,屬于低分辨率的研究,精度在10cM以內(nèi)64。應用連鎖分析對復雜的疾病進行研究時,可能由于疾病的遲發(fā)、缺少足夠的家系以及診斷不嚴格等因素,會嚴重

29、影響研究的準確進行。由群體遺傳學理論已知,在生物長期進化過程中,許多因子,如選擇、遷移、基因突變和遺傳漂變等,均可導致不同位點間的等位基因連鎖不平衡的產(chǎn)生。當群體隨機交配時,位點間的連鎖程度會隨世代交替而衰退,其衰減速率與位點間的重組率呈固定的對應關系。群體中連鎖不平衡的長期保持標志著QTL與標記位點存在緊密的連鎖關系。這樣,通過測定一個標記位點與潛在的QTL之間的連鎖不平衡程度即可斷定QTL所在的位置。與連鎖分析相比,連鎖不平衡與關聯(lián)分析所研究的群體中,帶有相同的等位基因或單倍體的個體親緣關系較遠,與典型的連鎖分析所用個體相比,有著更多的減數(shù)分裂。因此,關聯(lián)定位更精確。等位基因關聯(lián)研究是一種

30、非參數(shù)性方法,它對連鎖分析所顯示出的興趣區(qū)域進行候選基因位點和細致基因定位評價非常有用處,所以目前廣泛用來疾病基因的定位。對于常見的由高頻率、低風險等位基因引起的疾病,采用疾病位點等位基因的關聯(lián)分析比連鎖分析更為有效6 5。等位基因關聯(lián)是指疾病性狀的標記等位基因發(fā)生率的顯著性改變(增加或降低,它代表與疾病性狀或表現(xiàn)型相關的等位基因在隨機發(fā)生中的偏差66。等位基因關聯(lián)研究起源于變異(多態(tài)性的直接生物學行為,或者源于相鄰可疑基因連鎖的失衡。連鎖失衡常發(fā)生于二對共同遺傳數(shù)代并在位置上非?？拷牡任换?一般的規(guī)則是連鎖失衡越明顯,標記基因距疾病基因位點越近,但這還要受標記等位基因人群頻率和標記位點突

31、變率的影響。特殊表現(xiàn)型的優(yōu)勢選擇和隨機遺傳漂變,可使等位關聯(lián)分析復雜化。傳遞不平衡測試(transmission disequilibrium test, TDT被用來檢測遺傳性狀與標記之間的連鎖與關聯(lián)關系。當初TDT用來分析質(zhì)量或數(shù)量性狀時,需雜合親本的非相關后代作為研究群體,現(xiàn)已擴大了其使用范圍67,廣泛用在等位基因關聯(lián)研究中。有學者還專門研究了TDT在先天脊柱側(cè)凸和等位基因aggrecan關聯(lián)分析中的效率問題68。利用連鎖不平衡理論,人類遺傳學家已能把影響人類疾病的質(zhì)量基因定位在小至1cM區(qū)域內(nèi),有些基因已被克隆出來。Luo 69-71等人進一步發(fā)展統(tǒng)計分析方法檢測及估算分子標記與QTL

32、之間的連鎖不平衡系數(shù),從而提出了人類復雜遺傳疾病高解析度基因定位的理論策略。以此為基礎,胡中立等進一步探討了供試群體在雙親基因頻率存在差異時檢測QTL 和檢測QTL互作的方法,并給出了有關的理論結(jié)果72。有人發(fā)現(xiàn)連鎖/連鎖不平衡綜合分析,效果比單純連鎖分析或LD分析更好, 尤其是在影響性狀的基因比較多,QTL內(nèi)有大量的突變和標記密度較低的時候更為適用73。Bayesian法就是聯(lián)合運用了連鎖/連鎖不平衡綜合分析,由于充分考慮了每個標記和每個子代的信息,所以不管有無LD信息,Bayesian法均可以精確估計加性效應和顯性效應74。由于第三代遺傳標記SNPs數(shù)量多、分布廣泛、相對穩(wěn)定且易于篩查和基

33、因分型,在群體遺傳學得到廣泛應用,豐富了對群體遺傳學的認識,能更好了解基因型-表型的關系,極大提高了數(shù)量性狀的精細定位能力。對小部分染色體區(qū)域的研究表明:不同遺傳背景的SNPs可以引起相關群體不同標記的連鎖不平衡的明顯變化75。已經(jīng)證實:LD不僅與物理圖距有關,而且與標記所包含的信息有關。使用雙等位SNP標記,可以把LD固定在0.1cM左右76。為了更有效地應用連鎖不平衡進行關聯(lián)研究,必須仔細選擇具有相同病因起源的人群作為研究對象。總之,進行SNPs 關聯(lián)分析應考慮以下幾個方面:病例和對照人群起源相同,各項指標應有很好的對應關系。連鎖和關聯(lián)分析結(jié)合分析。采用一個或很少的標記得到的陰性相關結(jié)果并

34、不能排除其周圍序列對疾病的風險性。與疾病相關的陽性標記未必能確定其周圍的致病序列。應用致病等位基因與其周圍SNPs的連鎖不平衡性可提高關聯(lián)分析的效果。理論上,如果某一SNP與其附近的致病等位基因呈現(xiàn)較強的連鎖不平衡性,那么二者應該與疾病表現(xiàn)出相似的關聯(lián)性?？蓱靡幌盗须S機SNPs掃描其周圍的DNA序列以發(fā)現(xiàn)指示起病效應的關聯(lián)信號。由于基于連鎖不平衡進行的關聯(lián)分析采用的是一組隨機的多態(tài)性標記,并依賴于致病位點本身及其鄰近的標記具有足夠的連鎖不平衡性,所以這種方法在隔離人群中非常有效。因為隔離人群可能起源于同一祖先,群體的建立時問和群體的大小都是確定的,隔離可以排除混雜群體因素。群體的建立時間可以

35、提供與疾病相關基因突變形成的界限,而小群體也增加了疾病是由某一個體產(chǎn)生的可能性,從而增強了疾病與群體中一個特異單倍體的關聯(lián)。但對于其她群體來說,由于連鎖不平衡的不可預測性,基于連鎖不平衡進行關聯(lián)研究則比較困難77,78,這時可使用周圍基因組中的SNPs進行連鎖不平衡關聯(lián)研究79。對具有純合子型致病基因和固有連鎖不平衡的疾病人群進行嚴格選擇,同時還應考慮到單倍體之間的關系。有人對SNPs采用多點連鎖不平衡定位(multipoint linkage-disequilibrium mapping,不但可以縮小區(qū)間,還可以鑒定變異的異質(zhì)性,選用SNPs的總量下降38%,而可信區(qū)間的范圍縮小20%80。

36、在一些遲發(fā)疾病的關聯(lián)分析中,一些父母的基因型可能丟失。若沒有父母的基因型,家系分析時可比較受累個體與不受累同胞對之間等位基因頻率,或利用同胞來推測父母的基因型。統(tǒng)計軟件TRANSMIT就是利用了后一種方法。通過對血源一致性參數(shù)的估計,對父母傳遞和受累同胞之間的相關性進行調(diào)整。模擬數(shù)據(jù)表明,這種方法的效率比子代的不平衡測試和家系關聯(lián)分析的效率高,有人還用此方法對家族性Parkinson病的侯選基因進行了驗證81。聯(lián)合運用上述理論與方法,精細定位了控制牛奶成分的QTL。通過孫女設計(granddaught er design,在含有1158個個體的牛群中,對BT6q11-16區(qū)間內(nèi)9個微衛(wèi)星標記和

37、3個SNPs標記進行高密度遺傳圖譜的連鎖和關聯(lián)分析,精細定位了控制牛奶成分的QTL82-8 4,在這區(qū)間里的DGAT1基因可能是侯選基因85。人類的很多遺傳病也得到了精細定位。在一些人群中證實了HLA-DQA與1型糖尿病關聯(lián)關系86。通過對全基因組的掃描,在2號染色體上發(fā)現(xiàn)了一個與2型糖尿病強烈連鎖的區(qū)間87。在尋找與其相互連鎖的區(qū)間時,把該區(qū)間縮小至7cM。這個區(qū)間跨度只有1700kbp。在該區(qū)間運用多個SNPs的關聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)2型糖尿病可能與calpain-10 (CAPN10有關8 8。中國北方漢族人群2型糖尿病候選易感基因也取得了很大的進步。杜瑋南等通過增加微衛(wèi)星位點密度,擴大樣本量,

38、運用GeneScan和G enotyper程序獲得位點信息,最后經(jīng)參數(shù)和非參數(shù)連鎖分析,對1號染色體上的中國北方漢族人群2型糖尿病易感基因進行了驗證和精細定位89。并對其中的易感基因,蛋白激酶C亞型(PRKCZ內(nèi)的單核昔酸多態(tài)性進行群體相關分析及連鎖不平衡分析,表明PRKC Z基因內(nèi)由5個SNP位點組成的單體型可能和中國北方漢族人2型糖尿病相關,進一步從統(tǒng)計學角度證實了PRKC Z基因為該人群疾病易感基因90。血漿中淀粉樣蛋白(Abet92的水平,可以作為遲發(fā)阿爾采默病(LOAD的一個數(shù)量表型。有學者先是在10號染色體上80cM處,發(fā)現(xiàn)了顯著連鎖關系,受累同胞對的研究也證實了這一結(jié)果。接下去的

39、SNP連鎖不平衡分析,表明VR22與LOAD有相關性91。(四候選基因法進行QTL的精細定位候選基因法也是精細定位QTL的一種有效方法。根據(jù)已知的生理、生化知識選擇具有某種功能的基因(候選基因,通過分子生物學實驗檢測這些基因及其分子標記對特定數(shù)量性狀的效應,然后篩選出對數(shù)量性狀有影響的基因或標記,并估計出它們對數(shù)量性狀的效應值。目前設計了很多侯選基因的關聯(lián)分析法92。最簡單的設計是流行病學的病例-對照研究,比較病例與對照組中等位基因的頻率。疾病與可測危險因素的因果關系是其中的混雜因素。有兩種方法可以解決混雜因素的干擾:配對病例-對照研究,把對照個體與病例相配對,以消除潛在混雜因素如性別、年齡的

40、影響,每對配對分別檢查危險因素,觀察侯選基因在病例組中出現(xiàn)的頻率是否高于對照組。用親屬作為病例的對照。第一個設計的是非受累同胞作為對照。后來又設計了包括雙親的對照93,94。用候選基因法已成功地定位了一些基因,如豬的肥胖基因(Obesity、肌漿蛋白基因(Myogenin、雌激素受體基因(ESR、大腸桿菌k 88受體基因等95。雖然QTL的精細定位得到了快速的發(fā)展,但真正位置克隆的基因還不多。目前報道的還只有番茄果實重的主基因96,人類對苯硫脲嘗味敏感基因等97。但是隨著人類、小鼠等模式生物、水稻、玉米等植物基因組計劃的完成,必將推動QTL精細定位及位置克隆的巨大發(fā)展。參考文獻1. 陳竺。醫(yī)學

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