材料論文談依達(dá)拉奉對血管性癡呆大鼠海馬線粒體COX活性及基因表達(dá)的影響

1、材料論文|談依達(dá)拉奉對血管性癡呆大鼠海馬線粒體COX活性及基因表達(dá)的影響    血管性癡呆(VD)是多種因素參與的復(fù)雜病理過程，而線粒體氧化損傷起重要作用1。細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)是線粒體電子傳遞鏈上的末端酶，也是電子傳遞鏈限速酶，在細(xì)胞能量代謝過程中起關(guān)鍵作用。神經(jīng)元功能活動與COX活性密切相關(guān)。國內(nèi)外尚未見應(yīng)用自由基清除劑依達(dá)拉奉治療VD的研究。故本實驗通過觀察依達(dá)拉奉對VD大鼠COX的影響，探討其對VD大鼠的保護(hù)作用。  1 材料與方法, w: h4 4 Y' j 1.1 材

2、料 雄性Wistar大鼠，體重300350 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。RNA prep培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒、組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。One Step RNA PCR Kit購自TaKaRa公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。/ h3 3 f. ?3 G( u4 S( C$ n. I1.2 動物模型的制備及分組 采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎方法制備慢性前腦VD大鼠模型2。將VD模型鼠分為：依達(dá)拉奉(商品名必存，南京先生藥業(yè)公司)組(皮下注射，每日1次，3 mg/kg體重);甲磺酸阿米三嗪(都可喜)組(灌胃，每日1次，20 mg/kg體重)和模型組(灌胃，每日1

3、次，同容量生理鹽水)，各10只。另取10只鼠為正常對照組(灌胃，每日1次，同容量生理鹽水)，除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動脈外，其余過程與模型大鼠相同，以減少手術(shù)損傷造成的誤差。各組大鼠手術(shù)7 d起給藥，共20 d后取1及2個月為時間點，處死取腦。) h! c" x1 z! |# Y) G9 P. j 1.3 大鼠海馬組織線粒體COX活性檢測 取1 h內(nèi)新鮮海馬組織約0.5 g提取線粒體。在冰浴中剪碎，加分離介質(zhì)約58 ml(成分為25 mmol/L 蔗糖，75 mmol/L 甘露糖，50 mol/L 乙二胺四乙酸鉀鹽(EDTAK)，10 mmol/L TrisHCl，0.1 mol/L

4、 KCl，并加入肝素50 U/ml，pH調(diào)至7.2)，在冰浴中勻漿。制備好的肌勻漿在0下4 500 r/min離心5 min，留取上清。在0下10 000 r/min離心20 min，得到棕灰色沉淀少量，再用洗液(成分為25 mmol/L蔗糖，75 mmol/L甘露糖，50 mol/L EDTAK，0.1 mol/L KCl，pH調(diào)至7.4)洗2遍，離心后懸浮于0.3% 0.4 ml的分離介質(zhì)中備用。按文獻(xiàn)3的方法進(jìn)行COX活性檢測。取pH7.4的200 nmol/L的KH2PO4 0.5 ml，加入雙蒸水0.375 ml，2%(V/V)TritonX100 25 l，線粒體蛋白67 l(約2

5、030 g)和細(xì)胞色素C 33 l(20 mg/ml，用前以過量Vit C還原A550/A565>12)，用紫外分光光度計測定550 nm處細(xì)胞色素吸收值A(chǔ)的變化。2 9 '9 G2 n% j- S2 Z  m* O 1.4 RTPCR檢測線粒體COX的表達(dá)情況 按說明書操作。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(510 l)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用TAE(40 mmol/L TrisHAc，1 mmol/L EDTA)熱溶解0.8%1.2%瓊脂糖凝膠，稍冷后加入EB，鋪膠。DNA溶液中加凝膠加樣緩沖液(61)上樣電泳，電泳緩沖液也用1×

6、TAE，電壓為15 V/cm。電泳結(jié)束后，凝膠內(nèi)DNA于紫外燈下觀察并拍照。1 L5 A2 _! g7 n4 L2 y; ?( '1.5 大鼠海馬組織線粒體COX基因突變分析 提取組織基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物設(shè)計。根據(jù)GenBank登陸的大鼠mtDNA基因組(登陸號：X14848)全序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引物。COX在mtDNA基因組的位置是nt6 9917 674，設(shè)計3對引物;COX在mtDNA基因組的位置是nt8 5849 367，設(shè)計3對引物(表1)。PCR反應(yīng)結(jié)束，取5 l PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的基因擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。切膠時請注

7、意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA回收率。測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。對所測得的序列在GenBank上進(jìn)行BLAST，分析突變位點。表1 PCR擴(kuò)增引物; N& d7 X% B# R& j 1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。; k9 Y, S: j( y% E2 結(jié) 果* c- A# D* Q5 Q 2.1 各組大鼠海馬線粒體COX活性的影響 對各組大鼠海馬組織線粒體后COX活性檢測結(jié)果顯示：術(shù)后1、2個月依達(dá)拉奉治療組COX活性顯著高于相應(yīng)時間點

8、模型組(P<0.05)，并有高于都可喜組的趨勢。見表2。表2 各組大鼠海馬組織COX活性的影響與模型組同時間點相比：1)P<0.05;與治療前比較：2)P<0.01$ 3 8 W, X) u; Z7 W  2.2 各組大鼠海馬線粒體COX基因表達(dá)的影響5 '1 I& n3 P; J% q8 r& _! u, d 2.2.1 RTPCR分析線粒體COX的表達(dá) 提取組織總RNA后，進(jìn)行RTPCR，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在295 bp處出現(xiàn)陽性電泳帶，依達(dá)拉奉治療組表達(dá)量高于模型組，與都可喜組比較無差異。內(nèi)參照為bactin。見圖1。

9、3 j" m" z% m' T) A.正常對照組;B.模型組;C.都可喜組;D.依達(dá)拉奉組;E：DNA marker(DL2000); C2 e& z5 u* c  M& T: I' - z圖1 各組大鼠海馬線粒體COX的表達(dá)/ Q5 b% E* # t. j* u$ 2.2.2 COX基因突變分析) Z; K$ t9 E' R2.2.2.1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 以基因組DNA為模板，用相應(yīng)片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各組大鼠海馬COX和 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖2，片段大小在300400 bp左右。- f2 3

10、X' & m2.2.2.2 COX 和基因分析 應(yīng)用NCBI的BLAST 2 SEQUENCES RESULTS VERSION BLASTN 2.2.16分析軟件，將所測的每一個樣本的序列與GenBank登陸的mtDNA 進(jìn)行比對分析。查找、分析基因變異位點，從表3可見,模型組COX基因有5處突變，與正常對照組比，新出現(xiàn)2處突變，是堿基替換，7 082位的TG，氨基酸由ValGly，7 144位的CG，氨基酸由HisAsp，比正常對照組少了4個突變位點;依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)3處基因突變，比正常對照組少3個突變位點。與模型組比，依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)3處基因突變，少3處突變位點。與正常對

11、照組比，模型組COX基因新出現(xiàn)2個突變位點，是堿基替換，其中有1處是無義突變，另一處是8 641 GGACGA，氨基酸GlyArg，但比正常對照組少了1個突變位點。依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)2個突變位點，突變頻率減少，沒有對照組的突變位點。與模型組比，依達(dá)拉奉組沒有模型組的突變位點，也沒有正常對照組的突變位點。都可喜組而COX基因突變頻率較高既有正常對照組的突變位點，也有模型組的突變位點。表3 各組大鼠海馬組織線粒體COX和基因突變的影響 ( A' A1 h3 w  L& T* P 正常對照組COX COX模型組COX COX都可喜組COX COX依達(dá)拉奉組COX C

12、OX7 026 GCTGCC: j# a+ % S: , J 無義突變9 171 ATTCTT5 1 L0 x  M8 _3 i 無義突變7 026 GCTGCC3 t, p& d# 6 O: K4 a 無義突變8 640 ACAACG  S9 A4 L4 E% P+ f$ b 無義突變7 026 GCT& ! O' U: c) R8 A, f$ ( _ GCC無義突變8610 TAT: E8 A$ x. Z  ?4 j GATGluTyr7 018 CAAGAA8 616 AAC1 U1 9 L( O% _+

13、 j3 B- M- X9 M AGCAsnSer7 132 ACAGCA  '" v- |- '* v! D. " MThrAla9 182 AGCAGA5 : d  W9 ! d" O9 O' b4 P SerArg7 082 GTAGGA) / ( |" , b$ Q9 p& z7 m& ' r ValGly8 641 GGACGA+ P/ F5 - Z1 a: q) '# u$ V3 g GlyArg7 082GTA. y" W, S; N#

14、x) S# Z. ; GGAValGly9171 ATT; N( I3 d3 p3 h: # g4 C0 vCTTIleLeu7 026 GCTGCC$ _/ L$ S8 T5 P4 j4 R& h無義突變8 846 GTC! V( I+ Z; a$ c+ |8 YGCCValAla7 149 ACAACG& F3 r2 f! '. F2 f6 無義突變9 396 CTT. x; P) N" B4 x! B GTTLeuVal7 132 ACA: $ # k0 ! _' D% oGCAThrAla9 182 AGC1 S6 C5 3 d7 ?: NAG

15、ASerArg7 132 ACA( l+ / C9 F5 z, GCAThrAla9 182 AGC2 p; w# H7 e$ N; K' pAGASerArg7 040 ATAAAA# m0 F+ v7 m) a  b: R, X IlelY7 180 CAACAT& J9 q3 W+ G6 a" b  t GlnHis7 144 CACGAC- T) z! K8 R* c& J7 F HisAsp7 144 CACGAC: ?5 A+ P7 J/ D. E5 O HisAsp9396 CTT7 W$ z9 q/ Z-

16、 O* g/ E GTTLeuVal7 082 GTA1 d, G! j& h+ BGGAValGly7 189 CAACAT2 Y3 y4 q$ J0 H& '0 s% w8 Y0 iGlnHis7 149 ACAACG5 s- z% y( k) y, c 無義突變7 149 ACAACG' U' L( R0 R* t  i- X/ x$ f無義突變9397 CTT7 w' b/ B  u  x5 e1 Y5 'GGTLeuGly7 149 ACAACG$ r" 4

17、z4 o( W$ Y! 無義突變7 199 CTGTTG  ) T, ( q1 U& 無義突變7 385 TGA) Z: ' u9 2 ; F+ MGTTSTOPVal7 151 ACA1 G  # W" j2 c& n- b CCAThrPro7 339 TAGTAA" i* q5 _8 ?+ X1 " y無義突變7 386 ACT7 A! % K. x! d4    GCTThrAla7 429 AGAACA0 I: I# C/ o% G; j9 E0 N  

18、;t# j5 z: l. rArgThr* h* O4 c# '( x/ T, Q A：正常對照組COX1，B：模型組COX1，C：都可喜組COX1，D：依達(dá)拉奉COX1，E：正常對照組COX2，F(xiàn)：模型組COX2，G：都可喜組COX2，H：依達(dá)拉奉COX2，Mk：DNA Marker(DL2000)，I：正常對照組COX3，J：模型組COX3，K：都可喜組COX3，L：依達(dá)拉奉COX3，M：正常對照組COX4，N：模型組COX4，O：都可喜組COX4，P：依達(dá)拉奉COX4，Q：正常對照組COX5，R：模型組COX5，S：都可喜組COX5，T：依達(dá)拉奉COX5，U：正常對照組COX6，

19、V：模型組COX6，W：都可喜組COX6，X：依達(dá)拉奉COX6，Mk：DNA Marker(DL2000)/ X' Y, j3 m1 e1 e- m( O9 E( C 圖2 PCR擴(kuò)增COX、COX基因片段結(jié)果3 m+ S3 w( J# o( G- W) M2 t 3 討 論: c, Z1 u, C: 6 V5 # U0 V腦組織富含線粒體(mitochondria)，既是細(xì)胞呼吸和能量代謝的重要場所，又是氧自由基產(chǎn)生的主要部位。由于腦組織有較多的不飽和脂肪酸，耗氧量大，而抗氧化酶活性相對較低，因此易遭受自由基的氧化損傷。大量自由基一方面可引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，影響丙酮酸脫氫酶的活

20、性，使葡萄糖的氧化分解發(fā)生障礙，乙酰膽堿合成不足4，導(dǎo)致癡呆患者學(xué)習(xí)記憶呈漸進(jìn)性減退;另一方面，大量自由基還可損傷線粒體DNA(mtDNA)，導(dǎo)致其編碼的呼吸鏈復(fù)合物酶蛋白亞基表達(dá)下降，酶活性降低，進(jìn)一步危害能量代謝機(jī)制5。而線粒體又是細(xì)胞的能量代謝中心，已有許多研究報道，缺血時線粒體發(fā)生腫脹、變性、空洞化、數(shù)量減少等一系列退行性改變，因而線粒體被認(rèn)為在細(xì)胞缺血中具有重要的作用6，7。COX是細(xì)胞色素類物質(zhì)，是線粒體的標(biāo)志酶之一，定位于線粒體內(nèi)膜，是呼吸鏈集合體中電子傳遞鏈的末端酶及關(guān)鍵酶。與有氧代謝及內(nèi)呼吸密切相關(guān)，其活力直接影響線粒體氧化磷酸化過程，能真實地反映腦的能量代謝，是一個具有高敏

21、感性、可信性和可重復(fù)性的內(nèi)源性代謝標(biāo)記物。有研究表明，其活力下降會造成神經(jīng)細(xì)胞氧化磷酸化功能障礙和ATP合成減少8。缺氧時，COX等有氧代謝酶系活性下降9。其原因是由于線粒體損傷，海馬細(xì)胞中線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、合成ATP的能力下降，其內(nèi)酶擴(kuò)散至胞液或進(jìn)一步擴(kuò)散到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致活性下降;或由于細(xì)胞缺氧，電子傳遞鏈不能及時將電子傳給O2·，以及電子傳遞鏈上的COX等蛋白質(zhì)停滯于還原狀態(tài)所致10，11。本研究結(jié)果顯示：依達(dá)拉奉治療后COX活性及COX表達(dá)量較模型組顯著增加。模型組COX基因有5處突變，與正常對照組比，新出現(xiàn)2處突變，是堿基替換，7 082位的TG，氨基酸由ValGly，7 144位的CG，氨基酸由HisAsp，比正常對照組少了4個突變位點;依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)3處基因突變，比正常對照組少3個突變位點。與模型組比，依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)3處基因突變，少3處突變位點。與正常對照組比，模型組COX基因新出現(xiàn)2個突變位點，是堿基替換，其中有1處是無義突變，另一處是8 641 GGACGA，氨基酸