晶體-細(xì)胞的相互作用與腎結(jié)石

1、    關(guān)鍵字：腎結(jié)石草酸鈣(CaOx)是腎結(jié)石中最常見的晶體物質(zhì)，它在生物體液中的溶解度非常低。所有人尿中的CaOx都經(jīng)常處于過飽和狀態(tài)，在特定的過飽和環(huán)境中可能自發(fā)產(chǎn)生CaOx沉淀。結(jié)石病人以及正常人的尿中常可查到CaOx結(jié)晶，而結(jié)石病人的CaOx顆粒較大。腎結(jié)石的形成是腎內(nèi)一定大小的晶體潴留或粘附到腎小管上皮細(xì)胞上的最終結(jié)果。通常認(rèn)為決定腎結(jié)石發(fā)展的主要因素是小管液中草酸鹽的濃度，結(jié)晶調(diào)節(jié)因子的濃度和活性，以及腎臟內(nèi)晶體潴留。越來越多的證據(jù)表明，腎小管上皮細(xì)胞積極參與了腎結(jié)石的病理生理過程，研究CaOx晶體與腎小管上皮細(xì)胞的相互作用對(duì)探討尿石癥的發(fā)

2、生機(jī)制有重要意義。一、細(xì)胞模型的選擇目前已有適合使用的具有明確腎單位片段特征且能長期生長的細(xì)胞系。腎源性上皮細(xì)胞行組織培養(yǎng)時(shí)形成高度分化和有極性的單層細(xì)胞，頂部有微絨毛，并有連結(jié)復(fù)合體。在有滲透性的底物上培養(yǎng)的細(xì)胞比在硬塑料培養(yǎng)皿上的細(xì)胞分化程度高。根據(jù)研究機(jī)制選擇某一特定的細(xì)胞模型，近曲小管細(xì)胞常用于研究草酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，因?yàn)椴菟猁}的轉(zhuǎn)運(yùn)僅發(fā)生于腎單位的這一部分。細(xì)支以遠(yuǎn)可見CaOx晶體，因此，研究晶體與上皮細(xì)胞之間的相互作用常選擇具有遠(yuǎn)曲小管或集合管特征的腎細(xì)胞。LLC-PK1和OK-1細(xì)胞分別來源于Hampshire豬和美國負(fù)鼠，保留著許多近曲小管的特征，如Na+依賴的糖、氨基酸和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)

3、功能。取自正常雄性矮腳長耳獵犬腎臟的MDCK細(xì)胞被廣泛用作遠(yuǎn)曲小管或集合管的模型。兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞系具有完全不同的特征，這證明了細(xì)胞系的異質(zhì)性。用于腎結(jié)石研究的另一種腎上皮細(xì)胞是BSC-1，它取自非洲綠猴，具體起源不清5。也有用原代培養(yǎng)的大鼠腎髓質(zhì)集合管細(xì)胞(IMCD)研究晶體-細(xì)胞的相互作用。無論選擇哪種模型系統(tǒng)，一般說來都要進(jìn)行生理學(xué)方面的相關(guān)性研究，培養(yǎng)物在形態(tài)上和機(jī)能上應(yīng)盡可能模擬體內(nèi)的細(xì)胞模型。細(xì)胞系優(yōu)于原代培養(yǎng)，前者在分裂繁殖過程中形成單層，利于培養(yǎng)。細(xì)胞可凍存，將來可恢復(fù)培養(yǎng)，可用同一物質(zhì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。二、晶體粘附掃描電鏡和透射電鏡圖像顯示腎小管管腔表面吸附有晶體，細(xì)胞內(nèi)也存在晶體6。

4、在高草酸尿癥大鼠腎臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)比管腔直徑小得多的CaOx晶體沉積物吸附在腎小管上皮上。所有人的尿中都可查到晶體，提示晶體尿并非都是病理狀態(tài)。正常人的腎小管上皮細(xì)胞可更好地抵制晶體的粘附。細(xì)胞表面或晶體表面被功能性物質(zhì)如TH蛋白(THP)，腎鈣素(NC)，葡胺聚糖(GAGs)以及骨橋蛋白(OPN)覆蓋，從而得到保護(hù)。細(xì)胞表面糖綴合物結(jié)構(gòu)和成分的變化可使細(xì)胞包被失去阻止晶體粘附的作用7。一水草酸鈣(COM)在數(shù)秒內(nèi)即可與細(xì)胞表面結(jié)合，結(jié)合量與COM濃度有密切關(guān)系，這種粘附作用可被聚陰離子肝素阻斷。其它GAGs成分如硫酸軟骨素A，硫酸軟骨素B，硫酸乙酰肝素和透明質(zhì)酸也可阻斷這種粘附作用，而硫酸軟骨素C除

5、外。另兩種聚陰離子聚谷氨酸和聚天冬氨酸也有這一作用。尿中的NC，枸櫞酸以及OPN都可抑制晶體與細(xì)胞的結(jié)合，但THP沒有這種作用。用這些物質(zhì)預(yù)處理晶體可起阻斷效果，而預(yù)處理細(xì)胞無效，提示這些物質(zhì)是作用于晶體表面而起作用。抑制物對(duì)晶體結(jié)合的抑制遵循Langmuir吸附等溫式，表明晶體上抑制物分子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)二者之間的粘附至關(guān)重要。聚陰離子魚精蛋白可迅速逆轉(zhuǎn)晶體與細(xì)胞的粘附，這可解釋GAGs可逆性調(diào)節(jié)細(xì)胞晶體相互作用的現(xiàn)象8。至于為什么晶體對(duì)細(xì)胞表面有親和力，似乎不存在能與晶體結(jié)合的特異性細(xì)胞表面分子。正常情況下腎小管內(nèi)形成的晶體將隨尿排出。在某些條件下，晶體可獲得對(duì)細(xì)胞表面的高親和力，此時(shí)晶體結(jié)合可

6、由有吸引力的離子鍵或氫鍵介導(dǎo)，它必須克服快速流動(dòng)的小管液產(chǎn)生的剪切力。這種結(jié)合的證據(jù)源于對(duì)晶體片層與IMCD細(xì)胞表面磷脂片層的對(duì)比，提示晶體與質(zhì)膜間的接觸是基于互補(bǔ)分子的靜電和氫鍵9，10。另一方面，COM晶體的結(jié)合由細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的分子介導(dǎo)。聚陽離子可阻斷COM晶體與BSC-1細(xì)胞的粘附。此外，用神經(jīng)氨酸酶或肝素酶預(yù)處理的BSC-1和MDCK細(xì)胞可抑制COM晶體的結(jié)合力，提示唾液酸殘基和硫酸乙酰肝素是細(xì)胞表面與晶體結(jié)合的潛在受體6。而且COM晶體與MDCK細(xì)胞的結(jié)合似乎與pH或溫度有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)由鈣螯合誘導(dǎo)的質(zhì)膜頂部變形可促進(jìn)晶體的結(jié)合。根據(jù)以往的研究結(jié)果推斷，細(xì)胞損傷或細(xì)胞損害修復(fù)后反應(yīng)性

7、增生可使上皮極性喪失，從而觸發(fā)晶體潴留。質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞表面及小管液內(nèi)陰離子質(zhì)和量的變化，以及環(huán)境因素如pH的變化在晶體結(jié)合中可能起重要作用11。三、晶體內(nèi)化晶體一旦粘附到細(xì)胞表面，至少部分會(huì)被攝入細(xì)胞內(nèi)，這代表一種保護(hù)性機(jī)制，以去除細(xì)胞表面潛在的晶體生長點(diǎn)。另一方面，晶體胞吞可作為膜轉(zhuǎn)換的一個(gè)非特異性結(jié)果。一旦細(xì)胞內(nèi)晶體刺激細(xì)胞增生，可暴露新的膜功能區(qū)以供晶體結(jié)合，成為晶體聚集或晶體生長的位點(diǎn)。此外，有絲分裂也可松弛細(xì)胞與基底膜的粘附力，增加細(xì)胞脫落機(jī)會(huì)，從而暴露基底膜，成為尿晶體附著的位點(diǎn)，為結(jié)石形成奠定了基礎(chǔ)12，13。培養(yǎng)細(xì)胞的晶體胞吞作用受腎小管液中正常存在的復(fù)合物的影響，體

8、內(nèi)分子結(jié)構(gòu)的變化可影響這一過程。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)晶體的命運(yùn)目前尚不清楚。超微結(jié)構(gòu)研究顯示，進(jìn)入MDCK細(xì)胞內(nèi)的晶體于72小時(shí)后消失，提示細(xì)胞內(nèi)存在清除內(nèi)化晶體的調(diào)節(jié)機(jī)制。還不清楚晶體是被轉(zhuǎn)運(yùn)至基底部還是管腔內(nèi)，含晶體的細(xì)胞是否從單層上清除掉，然后被新細(xì)胞取代。晶體可能在細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酸性環(huán)境作用下溶解14。在高草酸尿癥病人及用致高草酸尿制劑處理的動(dòng)物中，其腎小管腔內(nèi)及腎間質(zhì)均發(fā)現(xiàn)CaOx結(jié)晶，提示管腔內(nèi)晶體可能被轉(zhuǎn)運(yùn)至間質(zhì)區(qū)。給予大鼠誘石飲食9天時(shí)，腎小管腔內(nèi)上皮旁有晶體聚積，部分生長過度。這一結(jié)果可解釋大顆粒向間質(zhì)移位，或許只有相對(duì)較小的晶體才被小管細(xì)胞內(nèi)化15。也有報(bào)道COM晶體可刺激間質(zhì)細(xì)胞生

9、長，可以推測(cè)，這些細(xì)胞的過度生長可影響細(xì)胞外基質(zhì)，后者反過來又刺激上皮細(xì)胞生長。四、細(xì)胞對(duì)草酸鹽晶體的應(yīng)答研究顯示，草酸鹽不但可為結(jié)石提供適宜的環(huán)境從而促進(jìn)晶體形成，該離子本身也可影響腎小管上皮細(xì)胞，使組織易于滯留晶體。特發(fā)性CaOx腎結(jié)石病人腎臟分泌反映細(xì)胞損傷的酶增加，這種損傷可能由離子化的草酸鹽引起16，17。用各種致高草酸尿制劑處理大鼠也可使尿中腎酶增高。草酸鹽對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的生存力及生長的影響表現(xiàn)為濃度依賴性的雙重作用。Scheid等8，19研究了不同濃度草酸鹽對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)游離草酸鹽濃度為140350mol/L時(shí)，細(xì)胞增生明顯，且有胞漿空泡形成及核固縮現(xiàn)象；當(dāng)游離草酸鹽濃度大于350mol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)目減少，核固縮細(xì)胞增多，提示低濃度草酸鹽是腎小管上皮細(xì)胞的分裂素，而高濃度草酸鹽有明顯細(xì)胞毒性作用。草酸鹽可刺激LLC-PK1細(xì)胞的癌基因c-myc表達(dá)，用c-myc的反義寡核苷酸預(yù)處理細(xì)胞可阻斷這一反應(yīng)，證明草酸鹽的促細(xì)胞分離效應(yīng)是通過c-myc基因的表達(dá)而起作用。草酸鹽可促進(jìn)培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞分泌OPN，在BSC-1細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入COM晶體后，COM迅速與培養(yǎng)基中的OPN結(jié)合，1小時(shí)后培養(yǎng)基中OPN下降46%，而24小時(shí)后OPN凈含量增加18%20。用Northernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)