晶體-細胞的相互作用與腎結石

1、    關鍵字：腎結石草酸鈣(CaOx)是腎結石中最常見的晶體物質，它在生物體液中的溶解度非常低。所有人尿中的CaOx都經常處于過飽和狀態(tài)，在特定的過飽和環(huán)境中可能自發(fā)產生CaOx沉淀。結石病人以及正常人的尿中常可查到CaOx結晶，而結石病人的CaOx顆粒較大。腎結石的形成是腎內一定大小的晶體潴留或粘附到腎小管上皮細胞上的最終結果。通常認為決定腎結石發(fā)展的主要因素是小管液中草酸鹽的濃度，結晶調節(jié)因子的濃度和活性，以及腎臟內晶體潴留。越來越多的證據表明，腎小管上皮細胞積極參與了腎結石的病理生理過程，研究CaOx晶體與腎小管上皮細胞的相互作用對探討尿石癥的發(fā)

2、生機制有重要意義。一、細胞模型的選擇目前已有適合使用的具有明確腎單位片段特征且能長期生長的細胞系。腎源性上皮細胞行組織培養(yǎng)時形成高度分化和有極性的單層細胞，頂部有微絨毛，并有連結復合體。在有滲透性的底物上培養(yǎng)的細胞比在硬塑料培養(yǎng)皿上的細胞分化程度高。根據研究機制選擇某一特定的細胞模型，近曲小管細胞常用于研究草酸鹽轉運機制，因為草酸鹽的轉運僅發(fā)生于腎單位的這一部分。細支以遠可見CaOx晶體，因此，研究晶體與上皮細胞之間的相互作用常選擇具有遠曲小管或集合管特征的腎細胞。LLC-PK1和OK-1細胞分別來源于Hampshire豬和美國負鼠，保留著許多近曲小管的特征，如Na+依賴的糖、氨基酸和磷酸轉運

3、功能。取自正常雄性矮腳長耳獵犬腎臟的MDCK細胞被廣泛用作遠曲小管或集合管的模型。兩個獨立的細胞系具有完全不同的特征，這證明了細胞系的異質性。用于腎結石研究的另一種腎上皮細胞是BSC-1，它取自非洲綠猴，具體起源不清5。也有用原代培養(yǎng)的大鼠腎髓質集合管細胞(IMCD)研究晶體-細胞的相互作用。無論選擇哪種模型系統(tǒng)，一般說來都要進行生理學方面的相關性研究，培養(yǎng)物在形態(tài)上和機能上應盡可能模擬體內的細胞模型。細胞系優(yōu)于原代培養(yǎng)，前者在分裂繁殖過程中形成單層，利于培養(yǎng)。細胞可凍存，將來可恢復培養(yǎng)，可用同一物質重復實驗。二、晶體粘附掃描電鏡和透射電鏡圖像顯示腎小管管腔表面吸附有晶體，細胞內也存在晶體6。

4、在高草酸尿癥大鼠腎臟內發(fā)現比管腔直徑小得多的CaOx晶體沉積物吸附在腎小管上皮上。所有人的尿中都可查到晶體，提示晶體尿并非都是病理狀態(tài)。正常人的腎小管上皮細胞可更好地抵制晶體的粘附。細胞表面或晶體表面被功能性物質如TH蛋白(THP)，腎鈣素(NC)，葡胺聚糖(GAGs)以及骨橋蛋白(OPN)覆蓋，從而得到保護。細胞表面糖綴合物結構和成分的變化可使細胞包被失去阻止晶體粘附的作用7。一水草酸鈣(COM)在數秒內即可與細胞表面結合，結合量與COM濃度有密切關系，這種粘附作用可被聚陰離子肝素阻斷。其它GAGs成分如硫酸軟骨素A，硫酸軟骨素B，硫酸乙酰肝素和透明質酸也可阻斷這種粘附作用，而硫酸軟骨素C除

5、外。另兩種聚陰離子聚谷氨酸和聚天冬氨酸也有這一作用。尿中的NC，枸櫞酸以及OPN都可抑制晶體與細胞的結合，但THP沒有這種作用。用這些物質預處理晶體可起阻斷效果，而預處理細胞無效，提示這些物質是作用于晶體表面而起作用。抑制物對晶體結合的抑制遵循Langmuir吸附等溫式，表明晶體上抑制物分子結合位點對二者之間的粘附至關重要。聚陰離子魚精蛋白可迅速逆轉晶體與細胞的粘附，這可解釋GAGs可逆性調節(jié)細胞晶體相互作用的現象8。至于為什么晶體對細胞表面有親和力，似乎不存在能與晶體結合的特異性細胞表面分子。正常情況下腎小管內形成的晶體將隨尿排出。在某些條件下，晶體可獲得對細胞表面的高親和力，此時晶體結合可

6、由有吸引力的離子鍵或氫鍵介導，它必須克服快速流動的小管液產生的剪切力。這種結合的證據源于對晶體片層與IMCD細胞表面磷脂片層的對比，提示晶體與質膜間的接觸是基于互補分子的靜電和氫鍵9，10。另一方面，COM晶體的結合由細胞表面帶負電荷的分子介導。聚陽離子可阻斷COM晶體與BSC-1細胞的粘附。此外，用神經氨酸酶或肝素酶預處理的BSC-1和MDCK細胞可抑制COM晶體的結合力，提示唾液酸殘基和硫酸乙酰肝素是細胞表面與晶體結合的潛在受體6。而且COM晶體與MDCK細胞的結合似乎與pH或溫度有關，并發(fā)現由鈣螯合誘導的質膜頂部變形可促進晶體的結合。根據以往的研究結果推斷，細胞損傷或細胞損害修復后反應性

7、增生可使上皮極性喪失，從而觸發(fā)晶體潴留。質膜的分子結構改變，細胞表面及小管液內陰離子質和量的變化，以及環(huán)境因素如pH的變化在晶體結合中可能起重要作用11。三、晶體內化晶體一旦粘附到細胞表面，至少部分會被攝入細胞內，這代表一種保護性機制，以去除細胞表面潛在的晶體生長點。另一方面，晶體胞吞可作為膜轉換的一個非特異性結果。一旦細胞內晶體刺激細胞增生，可暴露新的膜功能區(qū)以供晶體結合，成為晶體聚集或晶體生長的位點。此外，有絲分裂也可松弛細胞與基底膜的粘附力，增加細胞脫落機會，從而暴露基底膜，成為尿晶體附著的位點，為結石形成奠定了基礎12，13。培養(yǎng)細胞的晶體胞吞作用受腎小管液中正常存在的復合物的影響，體

8、內分子結構的變化可影響這一過程。進入細胞內晶體的命運目前尚不清楚。超微結構研究顯示，進入MDCK細胞內的晶體于72小時后消失，提示細胞內存在清除內化晶體的調節(jié)機制。還不清楚晶體是被轉運至基底部還是管腔內，含晶體的細胞是否從單層上清除掉，然后被新細胞取代。晶體可能在細胞內溶酶體的酸性環(huán)境作用下溶解14。在高草酸尿癥病人及用致高草酸尿制劑處理的動物中，其腎小管腔內及腎間質均發(fā)現CaOx結晶，提示管腔內晶體可能被轉運至間質區(qū)。給予大鼠誘石飲食9天時，腎小管腔內上皮旁有晶體聚積，部分生長過度。這一結果可解釋大顆粒向間質移位，或許只有相對較小的晶體才被小管細胞內化15。也有報道COM晶體可刺激間質細胞生

9、長，可以推測，這些細胞的過度生長可影響細胞外基質，后者反過來又刺激上皮細胞生長。四、細胞對草酸鹽晶體的應答研究顯示，草酸鹽不但可為結石提供適宜的環(huán)境從而促進晶體形成，該離子本身也可影響腎小管上皮細胞，使組織易于滯留晶體。特發(fā)性CaOx腎結石病人腎臟分泌反映細胞損傷的酶增加，這種損傷可能由離子化的草酸鹽引起16，17。用各種致高草酸尿制劑處理大鼠也可使尿中腎酶增高。草酸鹽對LLC-PK1細胞的生存力及生長的影響表現為濃度依賴性的雙重作用。Scheid等8，19研究了不同濃度草酸鹽對LLC-PK1細胞的作用，發(fā)現游離草酸鹽濃度為140350mol/L時，細胞增生明顯，且有胞漿空泡形成及核固縮現象；當游離草酸鹽濃度大于350mol/L時，細胞數目減少，核固縮細胞增多，提示低濃度草酸鹽是腎小管上皮細胞的分裂素，而高濃度草酸鹽有明顯細胞毒性作用。草酸鹽可刺激LLC-PK1細胞的癌基因c-myc表達，用c-myc的反義寡核苷酸預處理細胞可阻斷這一反應，證明草酸鹽的促細胞分離效應是通過c-myc基因的表達而起作用。草酸鹽可促進培養(yǎng)的腎小管上皮細胞分泌OPN，在BSC-1細胞系的培養(yǎng)基中加入COM晶體后，COM迅速與培養(yǎng)基中的OPN結合，1小時后培養(yǎng)基中OPN下降46%，而24小時后OPN凈含量增加18%20。用Northernblot方法檢測發(fā)現