抗角蛋白自身抗體對家兔接觸性皮炎的影響

1、    抗角蛋白自身抗體對家兔接觸性皮炎的影響        作為天然自身抗體(natural autoantibody,NAA)家族的一員，抗角蛋白自身抗體（antikeratin autoantibody, AK auto Ab ）廣泛存在于人和多種動物體內(nèi)?，F(xiàn)已明確NAA具有參與機體對外來損傷的非特異性防御、加速代謝產(chǎn)物的清除、抗炎等作用1。眾多學者在對 AK auto Ab 的研究中證實，其參與了機體和皮膚的多種生理和病理過程，對于維持表皮的自身穩(wěn)定具有重要意義2。為

2、了直接觀察 AK auto Ab 對皮膚病理狀態(tài)的影響，明確其在體內(nèi)的作用，并使 AK auto Ab 的應用向臨床過渡，我們對照觀察了人 AK auto Ab 對家兔刺激性接觸性皮炎的影響。一、材料和方法(一)試劑準備：按李承新等3的方法制備 AK auto Ab ，并應用鹽析法從親和純化 AK auto Ab 后的混合正常人血清中提取丙種球蛋白。(二)動物處理：取36只成年雄性新西蘭白兔（體重1.52.5kg；本校實驗動物中心提供），按文獻4用硫化鈉溶液誘發(fā)刺激性接觸性皮炎。隨機將動物分為3組，每組12只，分別對應于 AK auto Ab 組、去除 AK auto Ab 的丙種球蛋白對照組

3、(以下簡稱丙種球蛋白組)及空白對照組。肌內(nèi)注射給藥， AK auto Ab 組和丙種球蛋白組劑量為5mg/kg，空白對照組給予生理鹽水注射。每天給藥1次，連續(xù)給藥12d。硫化鈉作用前24h取家兔正常皮膚標本及耳靜脈血，作用后8h、第3、7、12天取皮損及對側正常皮膚標本和耳靜脈血。采用盲法，具體操作者不知實驗分組情況。(三)皮膚反應強度分級標準：參照有關文獻制定皮膚反應強度分級標準5,6。紅斑：無反應為0，散在紅點為0.5，非連續(xù)紅斑為1.0，連續(xù)紅斑為2.0，中度紅斑為3.0，重度紅斑為4.0。腫脹：無反應為0，輕度水腫為2.0，中度水腫為3.0，重度水腫為4.0。糜爛：無反應為0，輕度糜爛

4、為4.0，中度糜爛為5.0，重度糜爛或潰瘍?yōu)?.0。由3位未參與實驗者進行評分，取其平均值。(四)HE染色及有核細胞計數(shù)：冰凍切片，HE染色。高倍鏡下每個標本在真皮淺層隨機選5個視野，對真皮附屬器以外的有核細胞計數(shù)，以進行有核細胞密度定量檢測7。每張切片均由3人觀察及評分，取其平均值。(五)酶聯(lián)免疫吸附試驗：以本室制備人角蛋白為抗原,2BSA372h,倍比稀釋血清4過夜,羊抗人IgGHRP(華美公司)371h,OPD顯色，酶標檢測儀測492nm吸光值3。(六)S Ab C染色7：冰凍切片，冷丙酮固定30min，0.3H2O2甲醇溶液室溫20min，2BSA371h,14000生物素標兔抗人Ig

5、G抗體(Pierce公司)4過夜，S Ab C復合物(博士德公司)3730min，D Ab 顯色。二、結果(一)大體觀察：飽和硫化鈉溶液作用于家兔皮膚立刻引起局部紅斑、腫脹及少許糜爛，各組間反應較均勻一致；炎癥于12d內(nèi)達到高峰，之后炎癥反應減弱，修復增強。各組皮膚反應強度分級及統(tǒng)計結果見表1。第1、3天各組間差異無顯著性，第5天 AK auto Ab 組與空白對照組比較差異有顯著性，第712天 AK auto Ab 組與兩個對照組比較差異均有顯著性。提示 AK auto Ab 組炎癥消退速度明顯快于兩對照組，皮膚損傷修復快、愈合好。兩對照組比較差異無顯著性(統(tǒng)計結果未顯示)。(二)HE染色：

6、硫化鈉作用后8h，皮損表皮可見嚴重的細胞內(nèi)水腫，細胞間水腫較輕；真皮水腫、毛細血管擴張，大量的炎癥細胞浸潤。炎癥反應在3d以后開始減弱。以真皮淺層有核細胞記數(shù)來評價皮膚炎癥反應強度。各組細胞數(shù)及統(tǒng)計結果見表2。第1、3天各組間差異無顯著性，第7、12天 AK auto Ab 組與兩對照組出現(xiàn)顯著性差異。提示 AK auto Ab 組炎癥反應消退速度明顯快于兩對照組。兩對照組比較差異無顯著性(統(tǒng)計結果未顯示)。此外，丙種球蛋白組與空白對照組皮損表皮角質(zhì)形成細胞增生，真皮成纖維細胞、膠原增生明顯強于 AK auto Ab 組。(三)ELISA： AK auto Ab 組動物血清中可檢測到人 AK

7、auto Ab 存在，滴度為132164。丙種球蛋白組及空白對照組動物血清中未檢測到人 AK auto Ab 。 組別第1天第3天第5天第7天第9天第12天AK auto Ab 組17.83±1.3415.25±1.8212.92±1.519.83±1.646.55±1.513.18±1.17丙種球蛋白組17.42±1.1615.92±1.8314.17±1.7513.75±1.5411.42±1.319.33±1.49空白對照組17.67±1.3016.55

8、77;1.3715.00±1.0014.36±1.2112.27±1.2710.27±1.74t1值0.800.901.876.048.2810.94P1值>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01t2值0.301.923.867.659.6113.62P2值>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01注： AK auto Ab 組與丙種球蛋白組比較結果為t1、P1，與空白對照組的比較結果為t2、P2組別第1天第3天第7天第12天AK auto Ab

9、 組378.7±78.3355.1±63.3167.0±44.647.18±23.7丙種球蛋白組353.7±64.2340.3±50.8288.5±45.9154.0±21.3空白對照組355.7±69.5350.1±51.3306.9±30.6172.9±16.4t1值0.850.636.5511.38P1值>0.05>0.05<0.01<0.01t2值0.760.5011.7814.47P2值>0.05>0.05<0.01<

10、0.01注： AK auto Ab 組與丙種球蛋白組比較結果為t1、P1，與空白對照組的比較結果為t2、P2(四)S Ab C：給藥第7天以后 AK auto Ab 組動物皮損表皮角質(zhì)形成細胞胞漿中可見染色，空白對照組和丙種球蛋白組未見染色，對側正常皮膚表皮角質(zhì)形成細胞內(nèi)亦未見染色，提示 AK auto Ab 組動物皮損表皮角質(zhì)形成細胞胞漿中有人 AK auto Ab 沉積。三、討論本實驗肉眼及光鏡觀察均顯示 AK auto Ab 組動物皮膚炎癥消退迅速，皮膚損傷修復快、愈合好，與對照組差異有顯著性，而兩對照組間差異無顯著性。ELISA結果顯示 AK auto Ab 組動物血清中人 AK au

11、to Ab 持續(xù)存在。S Ab C染色顯示動物表皮角質(zhì)形成細胞內(nèi)人 AK auto Ab 的沉積。以上結果提示人 AK auto Ab 參與了動物皮膚損傷的炎癥及修復過程，并可能發(fā)揮了積極的作用。本實驗采用去除 AK auto Ab 的丙種球蛋白作為對照，排除了 AK auto Ab 作為免疫球蛋白的非特異性作用。本文結果還顯示人 AK auto Ab 具有同動物本身 AK auto Ab 相似的作用，進一步表明 AK auto Ab 積極參與了皮膚炎癥反應，并可能起到了促進作用。同時提示不同種屬間 AK auto Ab 可能具有較高的同源性和相似的生物學作用。國家新藥研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)項目資助

12、課題作者單位：李巍（710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科）李冰（710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科）劉玉峰（710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科）趙小東（710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科）李承新（710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科）黃慧（710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科）參考文獻1 Lacroix? Desmazes S, Kaveri SV, Mouthon L,et al. Self? reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. J Im

13、munol Methods, 1998,216:117 137. 2 Liu YF, Liu YF, Zhang TS, et al. Immunohistochemical study of anti keratin autoantibodies in both normal and pathological state. Chin Med J, 1993,106:393 395. 5 Arlette JP, Fritzler MJ. Reduced skin threshold to irritation in the presence of allergic contact dermatitis in the gu