細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力檢測(cè)方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上目前主要有兩種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過(guò)直接測(cè)定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測(cè)法并不能最終證明檢測(cè)樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測(cè)法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對(duì)照組的事實(shí)說(shuō)明藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以最直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力最經(jīng)典的方法是用氚標(biāo)

2、記的胸腺嘧啶核苷處理細(xì)胞，再檢測(cè)DNA鏈中氚含量。若細(xì)胞具有增殖能力，DNA合成過(guò)程中將會(huì)采用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷作為合成原料，因此檢測(cè)細(xì)胞DNA鏈內(nèi)標(biāo)記核苷酸的量可判斷細(xì)胞是否進(jìn)行DNA的合成。但更為常用的方法是BrdU檢測(cè)法。用BrdU預(yù)處理的細(xì)胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并帶到子代細(xì)胞中。細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定和變性處理后，可用免疫學(xué)方法檢測(cè)DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識(shí)別BrdU,再采用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記，最后用比色法或熒光的方法進(jìn)行定量測(cè)定），從而判斷細(xì)胞的增殖能力。Calbiochem/E

3、MD公司提供一種BrdU檢測(cè)試劑盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、變性的步驟以單一試劑當(dāng)中。比色檢測(cè)在一抗二抗標(biāo)記后在450nm下讀數(shù)，所有操作在3小時(shí)內(nèi)結(jié)束。而且該試劑盒的靈敏度與市場(chǎng)上其他同類產(chǎn)品相比是最強(qiáng)的。1000個(gè)細(xì)胞以上水平的檢測(cè)只需用BrdU預(yù)孵育2小時(shí)，100個(gè)細(xì)胞則采用過(guò)夜預(yù)孵育，即可檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。BrdU法的一個(gè)缺點(diǎn)是需要固定和變性等破壞DNA的處理。有些情況下，研究者可能希望在測(cè)定細(xì)胞增殖能力的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的總DNA含量，然而，在變性條件下，DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)將被破壞，DAPI和Hoechest 33342等核酸標(biāo)記探針就不再能識(shí)別DNA，因而也無(wú)法估計(jì)DNA總

4、量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU(5乙炔2脫氧尿嘧啶)檢測(cè)試劑盒可以解決這個(gè)問(wèn)題。這種方法不需要變性步驟，因?yàn)闊晒馓结槝?biāo)記的疊氮化物小分子，而不是龐大的抗體分子，可以很輕易的識(shí)別并結(jié)合未變性DNA雙鏈中的EdU分子。采用BrdU方法時(shí)，你必須非常小心的去對(duì)DNA進(jìn)行變性，才能一方面使BrdU抗體進(jìn)入細(xì)胞，另一方面又保留足夠的雙鏈DNA分子來(lái)進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。有了EdU后則不同，由于你不再需要變性，這一切都很簡(jiǎn)單了；另外，常常用于DNA變性的HCl，可能破細(xì)胞內(nèi)壞蛋白的抗原識(shí)別位點(diǎn)，因而限制了BrdU檢測(cè)法中同時(shí)檢測(cè)其他蛋白的應(yīng)用，但這種情況在EdU法中不存在

5、。 圖1：EdU及BrdU原理示意圖（摘至invitrogen說(shuō)明書）在一些情況下，細(xì)胞活力的檢測(cè)相當(dāng)于細(xì)胞增殖能力的測(cè)定。用于細(xì)胞活力檢測(cè)的方法又很多，這些方法主要采用特殊的試劑來(lái)測(cè)定細(xì)胞的代謝活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑鹽。它們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的氧化還原活性來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，所以這是一種間接的方法。Calbiochem的快速細(xì)胞增殖試劑盒，或者，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，叫細(xì)胞活力試劑盒，采用一種四唑鹽試劑WST-1來(lái)對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行快速的檢測(cè)。線粒體剪切WST1試劑，產(chǎn)生一種水溶性的formazan鹽，所以這是一種相對(duì)可靠的測(cè)定健康細(xì)胞活力的方法。一種類似的但更為靈敏的方法是Calbioc

6、hem公司的超敏細(xì)胞增殖試劑盒，采用calcein-AM（一種熒光探針）來(lái)標(biāo)記細(xì)胞。這種增加的靈敏度來(lái)自于額外的檢測(cè)步驟，即采用PBS替代培養(yǎng)基或血清來(lái)減小背景。Invitrogen公司還提供了一種采用熒光素酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平的方法。健康細(xì)胞中熒光素激發(fā)出的光可以很容易讀出，并且具有非常小的背景。無(wú)熒光信號(hào)表明細(xì)胞線粒體不在產(chǎn)生ATP。因此，這些方法當(dāng)然也可用于細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖檢測(cè)方法：總論一、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素3H標(biāo)記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過(guò)程，通過(guò)

7、測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DAN的代謝及細(xì)胞增殖情況。但是具有放射性。二、MTT檢測(cè)法MTT檢測(cè)法主要反映細(xì)胞的能量代謝，是檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法，其原理是在活細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲（Formazan），生成的甲量的多少與細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的活力成正比三、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測(cè)法羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，使C E成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFsE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。四、Brdu檢測(cè)法Brdu中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)