第5章免疫血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

1、第五章 免疫血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié) 凝集與沉淀反應(yīng)第二節(jié) 放射免疫測定技術(shù)第三節(jié) 免疫熒光技術(shù)第四節(jié) 酶免疫測定第五節(jié) 固相膜免疫測定凝集反應(yīng)： 細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞性抗原等顆粒性抗原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。一、 凝集反應(yīng)及其特點(diǎn)第一節(jié) 凝集與沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)過程：抗原抗體的特異性結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象凝集反應(yīng)特點(diǎn)：IgM的作用比IgG大數(shù)百倍IgG與抗原結(jié)合后，常不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱不完全抗體臨床意義：進(jìn)行細(xì)菌的抗原分析、鑒定及分型，也可應(yīng)用已知細(xì)菌檢查未知血清的抗體。多 克

2、 隆 抗 體單 克 隆 抗 體肌紅蛋白上清液肉眼可見的凝集現(xiàn)象直接凝集反應(yīng)(direct agglutination)： 顆粒性抗原直接與抗體結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。二、 直接凝集反應(yīng)（一）玻片凝集試驗(yàn)+ +方法評價:定性試驗(yàn)簡便和快速敏感度低臨床應(yīng)用:菌種鑒定血清學(xué)分型血型鑒定（二）試管凝集試驗(yàn)方法評價：半定量試驗(yàn)簡便、快速敏感度低可有假陽性臨床應(yīng)用：肥達(dá)氏試驗(yàn)：傷寒副傷寒外裴二氏試驗(yàn)：斑疹傷寒Wright test:布魯菌病交叉配血試驗(yàn)間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination)： 將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，

3、在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。載體種類：RBC（醛化）；聚苯乙烯膠乳顆粒（羧化）；金黃色葡萄球菌。三、 間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體-檢測抗體（一）間接凝集反應(yīng)的類型1、正向間接凝集試驗(yàn)用抗體致敏載體-檢測抗原2、反向間接凝集試驗(yàn)用抗原致敏載體-檢測抗原3、間接凝集抑制試驗(yàn)coagglutination test：以金黃色葡萄球菌菌體為反應(yīng)的載體。人及多種哺乳動物（豬、兔、豚鼠等）血清中IgG抗體的FC段與菌體表面的A蛋白（SPA）非特異性結(jié)合后，IgG的兩個Fab段仍然暴露在菌體表面，保持著結(jié)合抗原的活性和特異性。當(dāng)與特異性抗原相遇時，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。SPA-(Fc)IgG(

4、Fab)-AbSPA：staphylococcal protein A4、協(xié)同凝集試驗(yàn)（二）正向間接血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)強(qiáng)度1/21/21/41/41/81/81/161/161/321/321/641/641/1281/1281/2561/2561/5121/5121/10241/1024Pos.Pos.Neg.Neg.TiterTiter64648 8512512290% -半衰期60.2d12.3y標(biāo)記方法簡單復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備低廉昂貴測量條件簡單復(fù)雜一、放射免疫分析1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*與Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力，且兩者的總量大于Ab結(jié)合位點(diǎn)，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；

5、隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低，二者變化成函數(shù)關(guān)系。 以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*-Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/T(BF)與Ag的量變存在著劑量-反應(yīng)曲線。2、實(shí)驗(yàn)方法及測定AgAg* *AgAg平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法AbAb體積溫度時間pHAg*-標(biāo)準(zhǔn)；Ag-樣品二抗體沉淀法二抗體沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 試劑法試劑法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響 操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì) 結(jié)合與游離標(biāo)記物的分離二、免疫放射分析1、基本原理：以過量125I標(biāo)記抗體與待測

6、抗原進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng), 用固相免疫吸附劑對B或F進(jìn)行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單。 2、單位點(diǎn) IRMA先用過量標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用固相抗原結(jié)合游離的標(biāo)記抗體并將其分離, 測定上清液的放射量 3、雙位點(diǎn) IRMA先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過量的標(biāo)記抗體與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標(biāo)記抗體，測固相上放射性。 RIARIAIRMAIRMA標(biāo)記物抗原抗體原理競爭性結(jié)合非競爭結(jié)合反應(yīng)體系A(chǔ)g*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反應(yīng)動力學(xué)慢快靈敏度相對低高檢測范圍窄寬1-2數(shù)量級特異性差（PcAb）

7、優(yōu)（McAb）標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合率與測值成反比結(jié)合率與測值成正比待測抗原大小分子二抗原決定簇IRMA與RIA比較 將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測定。第三節(jié) 熒光免疫技術(shù)（一）熒光免疫分析的基本原理均相熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定熒光酶免疫測定非均相熒光免疫測定熒光偏振免疫測定熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)的類型熒光免疫測定液體樣品測定熒光抗體技術(shù)固體樣品測定直接法間接法雙標(biāo)記法熒光物質(zhì)ex（nm）em（nm）應(yīng)用異硫氰酸熒光素 (FITC)490495520530（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹

8、明 (RB200)570575595600（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)550620（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560595（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354430（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340613時間分辨熒光免疫測定熒光免疫測定中常用的熒光物質(zhì) 時間分辨檢測原理示意圖（二）時間分辨熒光免疫測定1、基本原理鑭系元素銪(Eu3+)（最常用）；釤(Sm3+)；鋱(Tb3+)；釹(Nd3+)；鏑(Dy3+)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景

9、110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA10002、標(biāo)記物常見熒光物質(zhì)的熒光壽命3、信號增強(qiáng)作用結(jié)合-二酮體Eu3+解離pH4熒光增強(qiáng)Eu3+標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物固相雙抗體夾心法原理示意圖固相抗體-待檢抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物在酸性增強(qiáng)液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。4、雙抗體夾心法待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體競爭結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測定熒光強(qiáng)度，熒

10、光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。5、固相抗體競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。6、固相抗原競爭法熒光偏振免疫測定原理示意圖 （三）熒光偏振免疫測定熒光酶免疫測定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖熒光酶免疫測定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖 酶標(biāo)記抗體或抗原，與固相載體包被的抗原或抗體特異性結(jié)合。洗去游離的酶標(biāo)物。加入底物，經(jīng)酶分解后生成熒光產(chǎn)物。（四）熒光酶免疫測定標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物 ex(nm) em(nm) 響應(yīng)信號堿性磷酸酶4-MUP4-MU36045010- 半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過氧化物酶H

11、PA二聚體3174140.03熒光酶免疫測定標(biāo)記用酶及熒光底物 固相抗體和酶標(biāo)記抗體與待檢抗原反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。1、雙抗體夾心法熒光酶免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖 固相抗原和酶標(biāo)抗原與待檢抗體反應(yīng)，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。 2、雙抗原夾心法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留下來，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。3、固相抗原競爭法抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗

12、核抗體(斑點(diǎn)型)（五）熒光酶免疫技術(shù)的應(yīng)用1、自身抗體檢測寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌 )2、病原體檢測腫瘤（人肝癌細(xì)胞）3、免疫病理檢測4、細(xì)胞表面抗原和受體檢測熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。 酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析 第四節(jié) 酶免疫測定一、基本原理（一）常用的酶及其底物1、辣根過氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法。四甲基聯(lián)苯胺 TMB。反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性。 2、

13、堿性磷酸酶（AP）對-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）。經(jīng)酶作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm。 3、 - 半乳糖苷酶（-Gal）多用于均相酶免疫測定。4MUG。經(jīng)酶作用后生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測量。（二）固相載體及其處理1、常用的固相載體塑料制品、微顆粒、膜載體。通過固相載體可以方便的將非均相酶免技術(shù)中游離的和結(jié)合的抗體（或抗原）酶標(biāo)記物迅速分離。2、固相載體的處理包被（coating）：將抗原或抗體結(jié)合于固相載體。封閉（blocking）：用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均

14、相非均相固 相 酶 免疫測定液 相 酶 免疫測定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量（三）酶免疫技術(shù)分類 均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛。常用于傳染病的診斷：病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對”、丙肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒；結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌。也用于一些蛋白質(zhì)的檢測：各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原）。（三）酶免疫測定的應(yīng)用 酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或

15、抗體的含量。常用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 。二、均相酶免疫測定1、酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique2、克隆酶供體免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzyme-linked immunosorbent assay（一）基本過程及試劑1、包被：固相的抗原或抗體 2、反應(yīng)：加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體。酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物） 3、洗滌：使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離4、底物顯色：定性或定量的分析。酶反應(yīng)的底物 1、雙抗體夾心法 方

16、法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色 應(yīng)用：二價或二價以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等（二）ELISA檢測抗原的方法雙抗體夾心法測抗原E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、競爭法 方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）競爭法測抗原E EE EE EE EE EE EE EE E1、間接法 方法：用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。 優(yōu)點(diǎn)：一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)

17、的抗體。 應(yīng)用：常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定。（三）ELISA檢測抗體的方法間接法測抗體E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似 應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體3、競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法 應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測 應(yīng)用于病原體急性感染診斷中的IgM型抗體、甲型肝炎HAV-IgM抗體、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體的檢測。原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包被鏈抗體包被捕獲待測標(biāo)本中捕獲待測標(biāo)本中IgMIgM類抗體類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記

18、特加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體異性抗原的抗體 底物顯色底物顯色 4、捕獲法捕獲法原理E EE EE EE EE E第五節(jié) 固相膜免疫測定一、常用的固相膜及其特點(diǎn)玻璃纖維素(fiberglass)，尼龍(nylon)，聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)，硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)多孔性-毛細(xì)管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原- 高度敏感性易于漂洗- 操作簡便固相NC膜 利用金溶膠中金顆粒高電子密度的特性，使其與抗體結(jié)合。顯微鏡下，金標(biāo)蛋白結(jié)合處可見黑褐色顆粒。當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。二、免疫金標(biāo)記技術(shù)Immunogold labelling techique 陽性陰性固相膜 固相抗原待測抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG 固相抗人IgG抗體IFA-雙抗體夾心法原理圖三、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)dot immunogold filtration assay, DIGFA/IFA金洗樣