生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、實(shí)驗(yàn)二 甲醛滴定法測(cè)定氨基氮1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?初步掌握甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量的原理和操作要點(diǎn)。2、 實(shí)驗(yàn)原理 氨基酸是兩性電解質(zhì)，在水溶液中有如下平衡： NH3是弱酸，完全解離時(shí)PH為1112或更高，若用堿滴定NH3所釋放的H來(lái)測(cè)定氨基酸，一般指示劑變色域小于10，很難準(zhǔn)確指示滴定終點(diǎn)。常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基化合物，使上述平衡右移，促使NH3釋放H，使溶液的酸度增加，滴定中和終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（PH=9.0左右）。因此可用酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定。 如樣品為一種已知的氨基酸，從甲醛滴定的結(jié)果可算出氨基氮的含量。如樣品為多種氨基酸的混合物(如蛋白質(zhì)水解液

2、)，則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)。但此法簡(jiǎn)便快速，常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度，隨水解程度的增加，滴定值也增加，當(dāng)?shù)味ㄖ挡辉僭黾訒r(shí)，表明已完全水解。3、 器材及試劑 1實(shí)驗(yàn)器材 25 ml錐形瓶；3 ml微量滴定管；吸管；研缽。2實(shí)驗(yàn)試劑 （1）300 ml 0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液 準(zhǔn)確稱取375 mg 甘氨酸，溶解后定容至100 ml。（2）500 ml 0.02 mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（3）20 ml酚酞指示劑 0.5%酚酞的50%乙醇溶液。（4）400 ml中性甲醛溶液 在50 ml 3637%分析純甲醛溶液中加入1 ml 0.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02 mol/

3、L的氫氧化鈉溶液滴定到微紅，貯于密閉的玻璃瓶中。4、 實(shí)驗(yàn)方法 1、取3個(gè)25 ml的錐形瓶，編號(hào)。向1、2號(hào)瓶?jī)?nèi)各加入0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液2ml和水5ml，混勻。向3號(hào)瓶?jī)?nèi)加入7 ml水。然后向三個(gè)瓶中各加入5滴酚酞指示劑，混勻后各加2 ml甲醛溶液再混勻，分別用0.02 mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至溶液顯微紅色。 重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)兩次，記錄每次每瓶消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)。取平均值，計(jì)算甘氨酸氨基氮的回收率。2、取未知濃度的甘氨酸溶液2 ml，依上述方法進(jìn)行測(cè)定，平行做幾份，取平均值。計(jì)算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克數(shù)。五、結(jié)果處理1. 回收率計(jì)算：甘氨酸氨基氮回收率實(shí)際測(cè)得量×100%加入理論量公式中實(shí)際測(cè)得量為滴定1和2號(hào)瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液毫升數(shù)的平均值與第3號(hào)瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液毫升數(shù)之差乘以標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的摩爾濃度，再乘以14.008。2. 氨基氮計(jì)算：氨基氮（mg/mL）=（V未V對(duì)）×NNaOH×14.0082公式中V未為滴定待測(cè)液耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的