版免疫學專業(yè)實踐能力培養(yǎng)技術(shù)指南1

1、免疫學實驗課的目的和要求免疫學是動物醫(yī)學科學領(lǐng)域中的一門重要學科。在學習免疫學的過程中，不僅需要掌握本學科的基礎(chǔ)知識、基本理論，同樣重要的是不能忽視免疫學作為實驗性科學而不斷發(fā)展的事實。因而，我們在教學過程中，注重對學生進行免疫學技術(shù)操作及實驗?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)。免疫學實驗課是整個免疫教學中重要的有機組成部分。一、實驗課目的：1加深和鞏固對系統(tǒng)理論知識的理解和體會。2熟悉和掌握免疫學實驗的基本技能。3培養(yǎng)正確的科學態(tài)度和思維分析能力。二、實驗課要求：1為提高實驗課效果，每次實驗前必須認真預(yù)習。了解實驗原理、材料與方法、注意事項以及預(yù)期的實驗結(jié)果。認真寫實驗計劃。2加強基礎(chǔ)訓練，每次實驗過程中應(yīng)注意基本

2、技術(shù)、基本操作、基本訓練。堅持嚴肅性、嚴格性和嚴謹性。3示教實驗和錄像實驗要仔細觀察。4自行操作要認真、準確。5為提高科學思維、分析、總結(jié)能力，每次實驗結(jié)束后必須認真地記錄結(jié)果，進行分析，得出結(jié)論，完成實驗報告。6. 全部實驗課結(jié)束后，以小組為單位，完成一份科研項目申請書的撰寫任務(wù)，并按時交給老師。實驗室守則1尊重教師、友愛同學，嚴肅認真，嚴謹求實。2進入實驗室應(yīng)穿白大衣，保持安靜，遵守秩序，不允許在實驗室接聽電話。3愛護儀器設(shè)備。節(jié)約試劑。尤其是貴重儀器的使用，未經(jīng)指導教師許可，不得擅自動用。如遇器材損壞或其它意外情況應(yīng)及時報告指導教師。4保持實驗室整潔、衛(wèi)生，實驗完畢后應(yīng)整理好器材、物品，

3、關(guān)好水、電、門窗，廢棄物應(yīng)根據(jù)不同性質(zhì)作適當處理，并將實驗室打掃干凈。桌椅放回原處。5. 嚴格遵守國家生物安全法和動物傳染病法，不得擅自處理試驗后的動物及其器官，要在專業(yè)教師的指導下進行嚴格消毒和無害化處理。本科生免疫學試驗計劃寫作格式淋巴細胞增殖 試驗計劃專業(yè)與班級姓名學號成績：1. 理論依據(jù)或原理；2. 本試驗的用途（舉例說明，例如，診斷、治療、疫苗評價等）；3. 目的（解決什么問題，達到什么要求）；4. 材料：必須有3種主要試劑的公司聯(lián)系電話、價格、試劑規(guī)格、 多 少優(yōu)惠、到貨時間、保存條件等；5. 儀器設(shè)備，規(guī)格，型號等注明；6. 試驗方法：寫明方法名稱，主要步驟等；7. 小組人員分工

4、：小組內(nèi)人員的安排；8. 注意事項，安全，衛(wèi)生，記錄等。注：實驗計劃應(yīng)在實驗開始前一周提交給任課教師。實驗報告的書寫獸醫(yī)免疫學、免疫學實驗報告按學校的統(tǒng)一格式進行書寫。特別注意：每次試驗結(jié)束后，要求各位同學到圖書館查找一篇學術(shù)論文，這篇論文的研究方法中應(yīng)用了你剛學過的方法，并要寫出短評，對其方法應(yīng)用是否合理作出評價。注：實驗報告應(yīng)在實驗結(jié)束后一周提交。實驗一 凝集反應(yīng)一、 目的1. 了解血清學方法的原理2. 血清學方法在微生物診斷中的作用3. 學會利用血清稀釋法測定免疫血清的效價。二、 原理：顆粒性抗原(如細菌或紅血球)的懸液與含有特異性抗體的血清混合，在適量電解質(zhì)存在的情況下，經(jīng)過一定時間，

5、出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。 參加反應(yīng)的抗原稱凝集原（滅活的布魯氏菌體），其血清（布魯氏菌陽性血清）中的抗體，稱為凝集素。凝集反應(yīng)的機制是由于抗原與其相應(yīng)抗體間存在著相對應(yīng)的極性基。極性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由親水溶膠變成疏水溶膠。疏水溶膠性質(zhì)不穩(wěn)定，水中的電解質(zhì)使抗原顆粒間的排斥力消除，從而產(chǎn)生了凝集現(xiàn)象。試管凝集反應(yīng)（agglutination in test tubes）是用已知顆粒性抗原檢測未知抗體及其相對含量的半定量試驗。此法為免疫血清定量測定效價法。三、應(yīng)用：凝集試驗可以用于定性的檢測，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽性或陰性；也可以進行半定量檢測，即將標

6、本作一系列倍比稀釋后進行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為血清效價?？蛇M行細菌的抗原分析、鑒定及分型，也可應(yīng)用已知細菌檢查未知血清的抗體。診斷傷寒、副傷寒病的肥達氏反應(yīng)（Widal test）、布魯氏菌病的瑞特氏反應(yīng)（Wright test）均屬定量凝集反應(yīng)。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測，其敏感度高于沉淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床檢驗。四、材料：（1）耗材：試管、試管架、移液器、記號筆；（2）試劑：生理鹽水、布魯氏菌懸液、陽性血清、陰性血清；（3）儀器：恒溫箱；五、方法：(1)取清潔干燥的小試管12支，排列在試管架上，（最好標記好序號，以免弄混）。(2)用移液管加入生理鹽水，

7、第1管加入2.3 m1 ，其余2-9管加入0.5m1生理鹽水。(3)用移液管吸取待檢血清0.5m1，注入第一管，并吸吹三次混勻；然后由第一管依次吸 取0.5m1注入第二管、第二管到第三管如此類推到第九管為止。（從第九管吸出0.5m1棄去）（以上九管為倍比稀釋）。（4）在每管中加入0.5m1經(jīng)處理的布魯氏菌菌懸液，作為抗原。第10-12管作為對照。第10試管為抗原對照，加抗原與生理鹽水。第十一管加陽性血清（0.5ml）和抗原。第十二管加陰性血清和抗原。(5)搖勻，并置37恒溫箱內(nèi)作用，次日再觀察結(jié)果。觀察結(jié)果時勿搖動試管六、觀察管底是否有凝集現(xiàn)象。記錄結(jié)果完全凝集，凝集塊完全沉于管底，液體澄清，

8、以“十十十十”記錄;凝集塊沉于管底，液體稍混，以“十十十”記錄;部分凝集，液體混濁，以“十十”記錄;極少凝集液體混濁以“十”記錄。無變化記以“一”*取“十十”的稀釋度作為免疫血清的效價。實驗二 沉淀試驗雙向免疫擴散試驗一、目的要求：1.掌握雙向免疫擴散試驗的原理和用途；2.熟悉雙向免疫擴散試驗的操作方法。二、實驗原理：1.沉淀反應(yīng)：可溶性抗原（如細菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液、病毒、組織浸出液等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗。2.抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。3.血清學反應(yīng)條件下，抗原抗體均帶負電荷，使極化的水分子在

9、其周圍形成水化層，成為親水膠體。當抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變薄；而且由于抗原抗體復(fù)合物形成后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。在電解質(zhì)作用下，各疏水膠體之間靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物。4. 雙向免疫擴散試驗：將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，使兩者各自向四周擴散，若抗原與抗體相對應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生特異性結(jié)合，并在比例合適處形成白色沉淀線。5.抗原抗體反應(yīng)的特點：1.特異性2.比例性3.可逆性6.帶現(xiàn)象：Ag與Ab比例不適而不出現(xiàn)可見反應(yīng)。前帶(prozone)抗體過量時；后帶(postzone)抗原過量時。7.沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、類脂、蛋白

10、質(zhì)或它們的結(jié)合物等。與相應(yīng)的抗體相比，抗原的分子量小，單位體積內(nèi)所含抗原量多，具有較大的反應(yīng)面積。因此，在作定量沉淀試驗時，為了不使抗原過剩而生成不可見的可溶性復(fù)合物，通常應(yīng)稀釋抗原。8.每一對應(yīng)抗原和抗體可出現(xiàn)一條沉淀線，出現(xiàn)沉淀帶的抗體最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價。9.參與沉淀試驗的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素。三、實驗用途：沉淀試驗廣泛應(yīng)用于病原微生物的診斷（雞馬立克氏病、法氏囊病、炭疽桿菌抗原），各種免疫血清效價和毒素、抗毒素的測定。四、材料：（1）耗材：平皿、試管、槍頭；（2）試劑：瓊脂粉、8.5% 高滲鹽水、待檢血清、法氏囊抗原；（3）儀器：高壓鍋、打孔器、移液器、濕盒、恒溫箱。五、實

11、驗方法：1.瓊脂板的制備：1克瓊脂粉溶于100ml 8.5% 高滲鹽水，高壓滅菌，待溫度降至55oC左右時，無菌操作下傾注于平皿中，制成厚約2mm左右的瓊脂板。2.打孔：在瓊脂板上打梅花孔，孔徑為2mm,中間空和周圍孔間的距離大約為3mm。3.加樣：將待檢血清作倍比稀釋，即1：2、1：4、1：8、1：16，分別加至周圍孔中，中間加抗原（法氏囊抗原）。4.作用：將瓊脂板放置濕盒中，在37oC恒溫箱中作用24h。5.結(jié)果觀察：抗原抗體在凝膠為擴散，在兩孔之間比例最適合的位置出現(xiàn)沉淀帶，出現(xiàn)沉淀帶的抗體最大稀釋倍數(shù)即抗體效價。四、注意事項：打孔加樣時，不要將瓊脂劃破，以免影響沉淀線的形成?？组g距要相

12、等。實驗三實驗動物接種方法一、試驗?zāi)康模菏煜げ⒄莆諏嶒瀯游锏囊呙缃臃N途徑與方法二、試驗原理：接種疫苗的目的是激發(fā)保護性免疫應(yīng)答并形成免疫記憶，從而使動物免遭感染的危害。疫苗種類：根據(jù)傳統(tǒng)與習慣，疫苗可分為減毒活疫苗、滅活疫苗、抗毒素、亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗等。接種途徑的確定應(yīng)根據(jù)疫苗種類、畜禽日齡及免疫目的而定，主要有以下幾種途徑：氣霧法、注射法（肌肉、皮下、皮內(nèi)、靜脈、腹腔內(nèi)）、飲水法、點眼、滴鼻法、灌胃法等。一般活苗采用飲水、噴霧、滴鼻、點眼、注射免疫，滅活苗則需肌肉或皮下注射。三、實驗材料：1ml注射器、生理鹽水、滴管、灌胃器、每兩人一只小鼠四、實驗方法：注射法（肌肉、皮下、皮內(nèi)

13、、靜脈、腹腔內(nèi)）、點眼、滴鼻法、灌胃法。1注射接種方法（1）皮下注射接種（多點注射法）皮下注射接種是將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環(huán)的過程。作皮下注射常選項背或大腿內(nèi)側(cè)的皮膚。操作時，常規(guī)消毒注射部位皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動，易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地將藥物注入皮下。拔針時左手拇、食指捏住進針部位片刻，以防止藥物外漏。注射量約為體重。（2）皮內(nèi)注射接種（多點注射法）是將藥液注入皮膚的表皮和真皮之間，觀察皮膚血管的通透性變化或皮內(nèi)反應(yīng)，接種、過敏實驗等一般作皮內(nèi)注射。先將注射部位的被毛剪掉，局部

14、常規(guī)消毒，左手拇指和食指按住皮膚使之繃緊，在兩指之間，用結(jié)核菌素注射器連接4.5針頭穿刺，針頭進入皮膚淺層，再向上挑起并梢刺入，將藥液注入皮內(nèi)。注射后皮膚出現(xiàn)一白色小皮丘，而皮膚上的毛孔極為明顯。注射量為0.1ml/次。（3）肌肉注射接種（多點注射法）小鼠體積小，肌肉少，很少采用肌肉注射。當給小鼠注射不溶于水而混懸于油或其他溶劑中的藥物時，采用肌肉注射。操作時1人保定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1條后肢，右手拿注射器。將注射器與半腱肌呈90°角迅速插入1/4,注入藥液.用藥量不超過0.1ml/10g體重.(4)靜脈注射接種將小鼠放在金屬籠或鼠夾中,通過金屬籠或鼠夾的孔拉出尾巴,用左手

15、抓住小鼠尾巴中部.小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈,2條動脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,3條靜脈呈品字型分布,一般采用左右兩惻的靜脈.拔去沿尾部靜脈走向的毛,置尾巴于45-50溫水中浸泡幾分鐘或用75%酒精棉球反復(fù)擦拭尾部,以達到消毒和使尾部血管擴張及軟化表皮角質(zhì)的目的.行尾部靜脈注射時,以左手拇指和食指捏住鼠尾兩側(cè),使靜脈更為充盈,用中指從下面托起尾巴,以無名指夾住尾巴的末梢,右手持4號針頭注射器,使針頭與靜脈平行(小于30°角),從尾巴的下1/4處進針,開始注入藥物時應(yīng)緩慢,仔細觀察,如果無阻力,無白色皮丘出現(xiàn),說明已刺入血管,可正式注入藥物.有的實驗需連日反復(fù)尾靜脈注射接種,注射

16、部位應(yīng)盡可能從尾端開始,按次序向尾根部移動,更換血管位置注射接種。注射量為體重。拔出針頭后，用拇指按住注射部位輕壓1-2min，防止出血。應(yīng)當注意，此途徑因繞過淋巴結(jié)，故不利于細胞免疫的建立。（5）腹腔注射左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠頭略低于尾部，右手持注射器將針頭在下腹部靠近腹白線的兩惻進行穿刺，針頭刺入皮膚后進針3nm左右，接著使注射針頭與皮膚呈45°角刺入腹肌，穿過腹肌進入腹膜腔，當針尖穿過腹肌進入腹膜腔后抵抗感消失。固定針頭，保持針尖不動，回抽針栓，如無回血、腸液和尿液后即可注射藥液。注射量為體重。2. 滴鼻接種左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，對準鼻孔滴入1-2滴

17、疫苗。待完全吸入后方能松手，吸入不準的要重滴。3. 點眼接種法左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，對準眼睛滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手，吸入不準的要重滴。4. 灌胃法小鼠專用灌胃針由注射器和喂管組成，喂管長約1nm，喂管尖端焊有一金屬小圓球，金屬球中空，用途是防止喂管插入時造成損傷。金屬球彎成20度角，以適應(yīng)口腔與食道之間彎曲。將喂管插頭緊緊連接在注射器的接口上，吸入定量的藥液；左手捉住小鼠，右手拿起準備好的注射器。將喂管針頭尖端放進小鼠口腔，壓迫鼠頭部，使口腔與食管成一直線。輕輕轉(zhuǎn)動針頭以刺激鼠的吞咽，將針頭順咽后壁輕輕插入食管下段，如遇阻力，可輕輕上下滑動，不能強行插入。一旦感覺

18、阻力突然消失有落空感時，輕抽注射器，如無氣泡抽出，則表明針頭已進入胃。如此時動物安靜，呼吸無異常，可將藥液注入。若動物出現(xiàn)劇烈掙扎，進針阻力很大或動物呼吸困難，則可能是插入氣管內(nèi)，此時必須立即退出重插。操作時動作輕柔以防損傷食管及膈肌。一般灌胃針頭插入長度小鼠為2.5cm-3.5 cm。用中指與拇指捏住針筒，食指按著針竿的頭慢慢往下壓，即可將注射器忠的藥液灌入小鼠的胃中。五、注意事項1. 注意安全，避免被動物咬傷。2. 注射器要避免重復(fù)使用，注射部位的消毒要徹底。實驗四免疫血清（多克隆抗體）的制備一、 目的要求： 加深對抗體基本知識的了解。 掌握多克隆抗體的制備及純化的基本方法。 熟練運用檢測

19、抗體效價的方法。二、 原理當將抗原注射入實驗動物體內(nèi)時，一系列抗體生成細胞會不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體。多克隆抗體中不同的抗體分子可以以不同的親和能力與抗原分子表面不同的部分抗原決定簇相結(jié)合。將抗原導入敏感動物體內(nèi)后，可刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)，尤其是淋巴結(jié)和脾臟中的淋巴細胞大量增殖。如圖所示，實驗動物對初次免疫和二次免疫的應(yīng)答有明顯的不同。通常初次免疫應(yīng)答往往比較弱，尤其是針對于易代謝，可溶性的抗原。首次注射后大約7天，在血清中可以觀察到抗體但抗體的濃度維持在一個較低的水平，在大約10天左右抗體的滴度會達到最大值。但同

20、種抗原注射而產(chǎn)生的二次免疫應(yīng)答的結(jié)果明顯不同，和初次免疫應(yīng)答相比抗體的合成速度明顯增加并且保留時間也長。免疫應(yīng)答的動力學結(jié)果取決于抗原和免疫動物的種類，但初次和再次免疫應(yīng)答之間的關(guān)系是免疫應(yīng)答的一個重要特點。三次或以后的抗原注射所產(chǎn)生的應(yīng)答和再次應(yīng)答結(jié)果相似：抗體的滴度明顯增加并且血清中抗體的種類和性質(zhì)發(fā)生了改變，這種改變被稱為免疫應(yīng)答的成熟，具有重要的實際意義。通常在抗原注射4-6周后會產(chǎn)生具有高親和力的抗體。三、 應(yīng)用在臨床上，多克隆抗體可用于緊急治療。在實驗室，多克隆抗體可用于蛋白質(zhì)的分離與鑒定，還可用于病原體的蛋白質(zhì)組學診斷。四、 材料 實驗動物供免疫用的動物主要是哺乳動物和禽類，常選

21、擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來決定，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)。如要獲得大量的抗體，多采用大動物；如要是獲得直接標記診斷的抗體，則直接采用本動物；如要獲得間接的標記診斷用抗體，則必須用異源動物制備抗體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備；一般實驗室采用的抗體，多用兔和綿羊制備。 免疫用的動物應(yīng)選擇適齡的健康雄性動物，雌性動物特別是妊娠動物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時甚至不產(chǎn)生抗體。由于對免疫應(yīng)答的個別差異，免疫時應(yīng)同時選用數(shù)只動物進行免疫。本實驗用成年健康遠交系公兔。 實驗器材家兔保定臺；刀片；25G針頭；1ml注射器；20

22、ml 血液收集管；藥匙；離心機以及塑料離心管；加樣器及加樣管；燒杯。 實驗試劑 抗原；乙醇；20mM 磷酸緩沖溶液pH7.2。 福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑： 福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑的成分成分 完全佐劑 不完全佐劑 石蠟油 6 份 + + 無水羊毛脂 4 份 + +殺死的分枝桿菌 3-5 mg + -磷酸緩沖溶液 10 份 + +（福氏完全佐劑的制備：使用前在福氏不完全佐劑中加入適量殺死的分枝桿菌）4. 乳化將抗原與佐劑混合的過程稱為乳化。乳化的方法很多，可采用研缽乳化；可直接在旋渦振蕩器上乳化；可用組織搗碎器乳化。少量時，特別是福氏佐劑與抗原乳化時，常采用注射器乳化，用兩個注射器，一個

23、吸入抗原液，一個吸入佐劑，兩注射器頭以膠管連接，注意一定扎緊，然后來回抽吸。當大量乳化時，可采用膠體磨進行。 五、 實驗方法 抗原的制備抗原制備的主要目的在于使被免疫動物能夠產(chǎn)生最強、最適當?shù)目贵w。由于純化的抗原適合產(chǎn)生抗體，因此在注射前通常采用一些經(jīng)典的方法，比如柱層析、分級萃取、凝膠電泳等進行抗原的分離和純化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中為清晰可見的單一條帶，將該條帶連同周圍的凝膠一塊切下，用適當緩沖液浸泡，使該多肽從凝膠中解離出來（此步稱為洗脫），即可制得純化的抗原。 對于從臨床病例中分離到的病原體，在國家法律許可的前提下，可直接與完全弗氏佐劑按一定比例混合，制成疫苗類似物。用此免疫

24、動物也可獲得高效價的多克隆抗體。 預(yù)放血輕輕的將兔子放在特制兔盒中，處于放松狀態(tài)的兔子采血會較容易。按壓兔子耳根部直至血管突出,然后將針頭插入耳部血管的中上部，觀察到進針后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。結(jié)束收集后，退出針頭并按壓傷處以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘以防止激活補體系統(tǒng)，再將試管在4°C放置過夜使血液凝固。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C，10,000g離心10分鐘，收集上清液在4°C保存。 注射抗原 準備兩只成年兔，將100µg抗原/兔溶入1ml磷酸緩沖溶液中

25、待用。在1ml福氏不完全佐劑中加入分枝桿菌制成完全佐劑，并加入1ml抗原溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個不同的部位進行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對皮膚15度的角度進針，進針深度為1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4個不同部位分別各注射約500µl抗原溶液。注射結(jié)束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個部位重復(fù)上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按

26、照步驟2收集血液。將收集的血液與注射前收集的血液進行比較，檢查是否有抗體產(chǎn)生。待確定產(chǎn)生抗體后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 收集血液 將家兔輕輕放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片傾斜45°在該處切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結(jié)束之前出現(xiàn)凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續(xù)收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒-20秒確定血流停止后方可結(jié)束。 將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，再在4°C放置過夜。用藥匙將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心

27、管中，4°C，10,000g離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，可在-20°C保存數(shù)年。六、 結(jié)果若用顆粒性抗原免疫動物，則用試管凝集法檢測抗體效價。若用可溶性抗原免疫動物，則用瓊脂擴散試驗檢測抗體效價。七、 注意事項1. 乳化一定要徹底（乳化好的標志是取一滴乳化劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散。如出現(xiàn)平展擴散即為未乳化好。乳化過的物質(zhì)放置一段時間（在保存期內(nèi)）出現(xiàn)油水分層也是未乳化好的表現(xiàn)。）2. 根據(jù)抗原的性質(zhì)和動物的免疫應(yīng)答狀態(tài)來決定免疫途徑、免疫次數(shù)和間隔時間等。 3. 細菌和異種動物細胞可直接用于免疫動物。4. 再次注射（即強化免疫）時應(yīng)減慢注射速度，以免動物出現(xiàn)超敏反

28、應(yīng)而死亡。5. 在制備抗原、免疫動物和收集血液等過程中，必須嚴格無菌操作。八、自助實驗（是由學生自己組織并自行實施的必做實驗）通過上述方法所制備的免疫血清只有在鑒定與純化后才能用于免疫學實驗，其目的是為了確定免疫血清中特異性抗體的含量，即抗體效價。常用微量滴定板法進行抗體效價的檢測。實驗動物為小鼠，其它試劑與材料參見溶血空斑實驗。實驗五 免疫細胞分離與計數(shù)一、 實驗?zāi)康?. 掌握Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞的技術(shù)與細胞計數(shù)法。2. 掌握脾細胞的分離與計數(shù)方法。二、 實驗原理外周血單個核細胞（peripheral mononuclear cells, PMBC）

29、包括淋巴細胞和單核細胞，其中T細胞約占50-70%，B細胞約占10-15%，單核細胞約占10-25%，還有部分NK細胞和其他細胞。常規(guī)的促分裂原誘導的T細胞增殖試驗和特異性抗原誘導的T細胞增殖試驗可直接用PMBC作為靶細胞，其中混雜的單核細胞可作為抗原遞呈細胞促進細胞增殖。對于要求較高純度T細胞的試驗，可以從PMBC中再純化T細胞。因此，分離和獲取外周血單個核細胞（PMBC）是檢測T細胞免疫功能的基礎(chǔ)。目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法直接分離PMBC。用來分離人和動物外周血PMBC的分離液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）泛影酸葡甲胺（U

30、rografin）(F/H)分離液。當將抗凝血疊加在淋巴細胞分離液表面水平離心后，由于紅細胞、粒細胞、單個核細胞、血漿等的比重不同，會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，即在離心管中出現(xiàn)5層：最上層是血漿（內(nèi)含血小板），血漿層和淋巴細胞分離液層之間是PMBC，淋巴細胞分離液層和最下面的紅細胞層之間是粒細胞層，又稱為棕黃層。吸取血漿與淋巴細胞分離液層之間的白色細胞，即為所需的PMBC。三、 試劑與材料1. 比重為1.077±0.001kg/L的淋巴細胞分離液；2. 無菌Hanks液（4。C冰箱保存，臨用時將PH值調(diào)至7.37.6）；3. 1%臺盼藍染液；4. 檸檬酸鈉抗凝劑；5. 含10%犢牛血清的RPMI

31、-1640培養(yǎng)液；6. 其它：無菌注射器、碘酒、酒精、無菌試管、無菌吸管、無菌槍頭、血球計數(shù)板、微量移液器、顯微鏡、計數(shù)器、水平離心機等。四、 操作步驟1. 在一15mL無菌離心管中加入適量的檸檬酸鈉溶液，采集雞靜脈血，迅速輕柔混勻;2. 取1mL抗凝血與等體積的無菌Hanks液混勻;3. 再取一無菌試管，加入1mL淋巴細胞分離液;4. 然后將2mL稀釋的血液沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液液面上;5. 將試管置于水平離心機中，2000rpm，離心20min；6. 用毛細吸管輕輕插到上層（血漿層）與中間層（分層液）之間的乳白色渾濁的PMBC層，吸取PMBC，然后移入另一試管中；7. 加入5倍體積

32、以上的Hanks液，輕輕混勻，1500rpm，離心15min，吸棄上清液。重復(fù)洗滌細胞2次；8. 末次離心后，棄上清，加入1mL含10%犢牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，重懸細胞；9. 取一滴細胞懸液與一滴1%臺盼藍染液混勻，于血球計數(shù)板上，計數(shù)4個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)；PMBC細胞濃度（細胞數(shù)/mL細胞懸液）=（4個大方格內(nèi)細胞總數(shù)/4）×104×2(稀釋倍數(shù))10. 細胞活力檢測：死細胞可被染成藍色、體積略膨大，活細胞不著色。計數(shù)200個淋巴細胞，計算活細胞百分率，正常情況下，活細胞百分率應(yīng)在95%以上人 活細胞百分率%=（活細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%五、

33、注意事項1. 采血時應(yīng)注意無菌操作，試驗中所用材料、試劑均應(yīng)無菌；2. 將稀釋的血液疊加于分層液上時，應(yīng)細心，動作輕柔，避免沖散分層液與分層液混合，進而影響分離效果；3. 吸取PMBC時，應(yīng)避免吸出過多上清液分層液而導致血小板污染；4. 試驗中所用的溶液均要求等滲，具有緩沖作用，并對細胞無毒性；5. 配置好的細胞可置于0-4。C暫時保存；6. 整個操作過程應(yīng)盡可能在短時間內(nèi)完成，減少死細胞數(shù)。六、自助實驗（是由學生自己組織并自行實施的必做實驗）小鼠脾細胞的分離與計數(shù)：現(xiàn)將小鼠實施安樂死，并對其體表進行徹底消毒，在左側(cè)季肋部將腹壁切開，暴露脾臟，切斷脾系膜，迅速將脾放入盛有RPMI 1640培養(yǎng)

34、基的平皿中，將脾臟的兩端各剪斷2mm，用注射器抽吸平皿中的培養(yǎng)基，再將針頭刺入脾臟的實質(zhì)內(nèi)，輕推注射器活塞，使培養(yǎng)基進入脾臟內(nèi)，于是在高壓下，脾內(nèi)的淋巴細胞被沖出，反復(fù)幾次，直至脾臟的顏色顯著變淺。收集平皿中的培養(yǎng)基，按上述方法進行淋巴細胞計數(shù)。實驗動物為小鼠，其它試劑與材料同上。實驗六 免疫細胞的活力測定1、 實驗?zāi)康模赫莆粘Ｓ玫募毎钚詼y定方法。2、 實驗原理：在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞樣本中活細胞所占的百分比叫做細胞活力。本實驗應(yīng)用臺盼藍染色技術(shù)測定免疫細胞的活力，因為正常健康的細胞具有完整的細胞膜而能夠排斥臺盼藍，不著色；而臺盼藍卻能擴散到細胞膜完整性喪失而死亡

35、的細胞中，使其著色。借助細胞對染料臺盼藍的排斥作用可以測定細胞群體中活細胞的數(shù)目。3、 實驗材料和試劑：1、細胞總數(shù)已知的細胞懸液2、1%臺盼藍染液3、其它：無菌試管、無菌吸管、無菌槍頭、血球計數(shù)板、微量移液器、顯微鏡、計數(shù)器等。4、 實驗方法：1、取0.5ml已計數(shù)的細胞懸液加入無菌試管中。2、加入1%臺盼藍染液0.5ml ，染色23min。3、吸取一滴染色后懸液涂于血球計數(shù)板上。4、于顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的死細胞數(shù)（著染為藍色）。5、計數(shù)出的死細胞數(shù)，按下式計算出細胞存活率。 細胞存活率=（細胞總數(shù)-死亡數(shù)）/細胞總數(shù)×100%五、備注： 1、死細胞能被臺盼藍染色，鏡下可見深

36、藍色膨脹細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。 2、計數(shù)時要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。實驗七 淋巴細胞增殖試驗一、 目的要求：1. 掌握淋巴增殖試驗的原理與用途；2. 熟悉淋巴細胞增殖試驗常用的技術(shù)方法。二、實驗原理：1.淋巴細胞增殖試驗又稱淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（Lymphocyte proliferation / transformation test）,是指淋巴細胞在體外培養(yǎng)時，受到特異性抗原或非特異性促有絲分裂原（如植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A (ConA)）刺激后，可出現(xiàn)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸合成增加，細胞體積增大，胞質(zhì)增加，出現(xiàn)空泡，核仁明顯，染色質(zhì)疏松，并能進行分裂的淋巴

37、母細胞，此稱為淋巴細胞增殖或淋巴細胞轉(zhuǎn)化，其增殖能力或轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機體的細胞免疫水平。 淋巴細胞增殖試驗常用的方法有形態(tài)學方法、3H-胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR)摻入法，MTT比色以及熒光染料流式細胞儀計數(shù)法等，可根據(jù)不同的試驗條件及試驗?zāi)康?，選擇不同的試驗方法。2.本試驗?zāi)康氖切螒B(tài)學方法，觀察小鼠血液中的T淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中，當加入促有絲分裂原ConA(刀豆蛋白A)刺激后，可轉(zhuǎn)化為體積較大的淋巴母細胞，胞漿增多而深染，核增大并可見核仁，把細胞制成涂片，在顯微鏡下可觀察到細胞轉(zhuǎn)化的典型形態(tài)。為什么只考慮T淋巴細胞而不考慮B淋巴細胞？因為： 促有絲分裂原 小鼠T細胞 小鼠B細胞

38、 ConA / PHA + -也就是說，ConA / PHA能刺激T細胞增殖，而不能刺激B細胞，而其他細胞如中性粒細胞在培養(yǎng)72h后，絕大部分衰變或死亡成碎片。三、應(yīng)用：該實驗是細胞免疫學功能檢測的一項基本技術(shù)，即可在臨床上作為測定機體細胞免疫功能的指標之一，也可用于免疫藥理學的研究，T細胞功能檢測（新藥開發(fā)，疫苗研制）。四、實驗材料1. 動物：清潔級小鼠20只/班；2. 試劑：肝素抗凝劑，RPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基，NH4cl (8.5g/L),甲醇，吉姆薩-瑞士染液，ConA；3. 耗材：無菌青霉素小瓶，離心管，吸管，載玻片；4. 儀器：離心機，水浴鍋，CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡。五、試驗

39、方法：1. 先向無菌的1.5ml離心管中加入肝素抗凝劑50l；2. 取清潔級小鼠，75%酒精消毒（吸水紙吸干），在無菌操作臺中用酒精棉球?qū)⑿∈笱矍蛑車荆瑹o菌條件下摘取眼球采血，滴入盛有抗凝劑的離心管中；采血方法3. 取無菌肝素抗凝血0.3ml加入盛有2.7ml RPMI-1640培養(yǎng)液的無菌青霉素小瓶中，同時加入刀豆蛋白（ConA）(5g/ml)0.05ml,對照組不加ConA; 或ConA2g/ml加入1×107淋巴細胞。4. 將細胞置37,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每天搖動1次；5. 培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物搖勻并移入1.5ml離心管中，1500r/min×10min

40、；6. 棄上清，用4ml氯化銨液在室溫下溶解紅血球，約10min, 1700r/min×10min，棄上清；7. 取沉淀細胞推片，火焰固定，滴數(shù)滴瑞氏-吉姆薩染液入玻片蓋滿標本，4min，再加入2-3滴PBS倍染1-3 min，傾去染液，蒸餾水洗，上油鏡觀察。六、油鏡觀察結(jié)果：轉(zhuǎn)化的淋巴細胞體積增大，直徑約20-30m，形態(tài)不整齊，常有小突起，核變大，有核仁1-2個，胞漿增多，常出現(xiàn)胞漿空泡。未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞直徑一般為6-8m，核染色致密，一般無核仁。油鏡下計數(shù)200個淋巴細胞，按下式計算轉(zhuǎn)化率。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率=（轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)÷200）×100%七、注意事項：

41、實驗中須嚴格無菌操作，防止污染。實驗八 酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）一、目的要求1. 熟悉酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理及用途；2. 掌握生物素-親和素系統(tǒng)ELISA法的原理和操作方法。二、原理 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)。生物素-親和素系統(tǒng)ELISA（BA-ELISA）法是結(jié)合生物素（Biotin）與親和素（Avidin）間的高度放大作用，建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，可以和生物素分子親密結(jié)合；生物素很易與蛋白質(zhì)（如

42、抗體等）以共價鍵結(jié)合。首先將抗原（或抗體）結(jié)合到聚苯乙烯微量反映板孔中并保持其免疫活性；然后加入待檢標本（測定其中的抗體或抗原），使其與聚苯乙烯微量反映板孔中的抗原或抗體起反應(yīng)；再加入生物素和辣根過氧化物酶標記的親和素。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特技性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原（或抗體）分子的目的。三、應(yīng)用：ELISA法可以檢測體液中微量的特異性抗體或抗原，故廣泛用于動物傳染病的診斷、獸醫(yī)藥理學試驗、食品衛(wèi)生檢驗和各種細胞蛋白質(zhì)的定量檢測。四、材料：1.試劑：動物干擾素(IFN-)ELISA試劑盒 1個/班

43、；2.儀器：酶標儀，移液器；3.耗材：槍頭，酶標板。五、操作步驟（用于檢測未知抗原的BA-ELISA）：1.包被抗體：（1）配制包被緩沖液：取出包被緩沖液原液，用去離子水將其10倍稀釋（0.4ml:3.6ml）；（2）稀釋抗體（Capture Ab）:用包被緩沖液稀釋抗體（4l:4ml）；（3）在每個聚苯乙烯酶標板的反應(yīng)孔中加100l，用封板膜封板，放入濕盒中4過夜（18-24h）；2.洗板：次日，棄取孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液（每孔200l）洗1次，每次2min；3.封閉：（1）配液（Assay diluent）:用去離子水5倍稀釋Assay diluent:5×Assay dilue

44、nt: 去離子水=1:4=4ml:16ml（2）每孔加200l，室溫孵育10min；4.洗板：同2；5.加樣：（1）配標準樣：分別配成2000pg/ml,1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.25 pg/ml,15.625 pg/ml;（2）在第一豎排的孔中加入100l/well配好的標準樣，用于制作標準曲線；（3）加待測樣：加入待測樣品100l/well（未知抗原）于反應(yīng)孔中，同時作空白孔。用封板膜封板，放入濕盒中37孵育10min,洗板；6.加生物素：（1）稀釋Detection Ab: Detection Ab: A

45、ssay Diluent=1l:1ml=4l:4ml（2）加于每孔100l，用封板膜封板，放入濕盒中37孵育10min,洗板；7.加A-HRP:（1）稀釋Avidin-HRP(辣根過氧化物酶標記的親和素)： Avidin-HRP：Assay Diluent=16l:4ml（2）加于每孔100l，用封板膜封板，放入濕盒中37孵育10min,洗板；8.底物顯色：于上述各反應(yīng)孔中加入TMB底物應(yīng)用液（Substrate）100l，室溫孵育10min;9.終止反應(yīng)：加2M H2SO4 50l/well以終止反應(yīng)；10. 結(jié)果測定：450nm酶標儀提前30min預(yù)熱，讀出OD值，分析數(shù)據(jù)。六、注意事項；

46、1. 加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不要濺出，不可產(chǎn)生氣泡。每次加標本應(yīng)更換槍頭，以免發(fā)生交叉污染。2. 在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，為把非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來，充分的洗滌和浸泡是必要的。實驗九 腹腔巨噬細胞收集與吞噬試驗一、目的要求1. 掌握分離小鼠腹腔巨噬細胞的操作方法；2. 掌握巨噬細胞吞噬功能測定的原理；3. 掌握巨噬細胞吞噬功能測定的操作方法。二、實驗原理巨噬細胞是機體固有免疫的重要組成細胞，同時又是一類主要的抗原提呈細胞，在特異性免疫應(yīng)答的誘導與調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用：巨噬細胞能有效的吞噬和清除病原微生物；巨噬細胞能夠有效的

47、加工和處理抗原，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答；巨噬細胞能夠介導并促進炎癥反應(yīng)；巨噬細胞對腫瘤和病毒感染細胞具有強大的殺傷功能。因此，巨噬細胞的分離和檢測對于了解機體的免疫功能狀態(tài)具有重要意義。小鼠是分離巨噬細胞最常用的材料來源。由于直接收集小鼠腹腔巨噬細胞的數(shù)量較少，因此通常先于小鼠腹腔內(nèi)注射刺激劑（如6%可溶性淀粉肉湯、石蠟油、蛋白胨、血清或甘油等）誘導巨噬細胞滲出、聚集，然后收集腹腔滲出液中的巨噬細胞。巨噬細胞具有吞噬較大顆粒性異物的特性。如將雞紅細胞注入小鼠腹腔，腹腔巨噬細胞將會吞噬雞紅細胞，并進一步將其消化。取小鼠腹腔液涂片，染色，在顯微鏡下可見雞紅細胞被吞噬的現(xiàn)象。計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，可

48、判斷巨噬細胞的吞噬功能。同時，通過觀察紅細胞被消化的程度，可以判斷巨噬細胞的消化能力。本試驗采用小鼠腹腔內(nèi)注入雞紅細胞法檢測巨噬細胞的吞噬功能。三、應(yīng)用 該方法可廣泛用于獸藥的篩選與臨床治療效果評價。四、材料1. 實驗動物：清潔級小鼠20只/班，雞1只；2. 試劑：阿氏液，生理鹽水，牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，磷酸氫二鉀，蒸餾水，0.1mol/L氫氧化鈉，可溶性淀粉，75%酒精棉球，生理鹽水，甲醇，瑞氏-吉姆薩染液，PBS，瑞氏染粉，吉姆薩染粉，甘油；3. 儀器：冰箱，離心機，顯微鏡；1. 耗材：離心管，吸管，濾紙，眼科鑷子、剪子、載玻片。五、實驗準備1. 雞紅細胞 按1：5比例保存于阿氏保養(yǎng)液中

49、，置4oC冰箱可保存一個月。臨用前，將雞紅細胞懸液用生理鹽水洗滌3次，2000r/min,離心5min,棄上清，按壓積比用生理鹽水配成1%雞紅細胞懸液。2. 肉湯培養(yǎng)液：（1）按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胴及牛肉膏），置于燒杯中。 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化鈉 0.5g 磷酸氫二鉀 0.1g 蒸餾水 100ml(2)將上述成分混合加熱溶解后，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整酸堿度至pH7.4-7.6。(3)將pH測定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過濾。(4)可溶性淀粉肉湯 取可溶性淀粉6g加入肉湯培養(yǎng)液100ml中，混勻后煮沸滅菌備用。3.瑞氏姬姆薩染色方法原料：A：瑞氏染色劑

50、0.8-1克；吉姆薩染色劑0.5克B：甘油33mlC：甲醇500ml配法：將A放入研缽中，加入少量B研磨，再加入少量B研磨，靜置5 min，倒出液體，將未溶部分繼續(xù)加入B研磨，直至染色劑全部溶解，再加入C研磨均勻，或中間加入C，并徹底研磨均勻，靜置后倒入深棕色瓶內(nèi)保存。六、實驗方法1. 試驗前三天，于小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉肉湯，每只2ml。注意針尖勿傷及內(nèi)臟。2. 試驗時，于小鼠腹腔注射1%雞紅細胞懸液每只1-2ml,并輕揉腹部。3. 注射后30min,于小鼠腹腔注射生理鹽水每只5ml,并輕揉腹部數(shù)次（10min），使腹腔內(nèi)液體與細胞充分混合。4. 用頸椎脫臼法處死小鼠，用注射器吸出小鼠腹

51、腔液，注于離心管中，1500r/min離心10min,棄上清。5. 結(jié)果觀察：(1) 取細胞懸液一滴滴于潔凈載玻片上，推成薄片或涂片，火焰固定，滴數(shù)滴瑞氏-吉姆薩染液入玻片蓋滿標本，1min，再加入PBS倍染1-3min，傾去染液，蒸餾水洗，用油鏡觀察。(2) 取細胞懸液一滴滴于潔凈載玻片上，推成薄片或涂片，火焰固定，滴數(shù)滴臺盼藍染液入玻片蓋滿標本，5min，再加入PBS倍染30s，傾去染液，用40倍物鏡觀察。七、結(jié)果判斷：鏡下可見巨噬細胞核呈藍色，被吞噬的雞紅細胞呈橢圓形，核呈藍色，而胞漿被染成紅色。鏡下隨機計數(shù)100個巨噬細胞，記錄吞噬有雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)和被吞噬的雞紅細胞總數(shù)，分別計算

52、吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率（%）=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞總數(shù)/100（巨噬細胞）×100%吞噬指數(shù)的計算公式：吞噬指數(shù)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞總數(shù)/100（巨噬細胞）實驗十 溶血空斑試驗三、 目的a) 掌握溶血空斑試驗的原理和用途2. 熟悉溶血空斑試驗的操作方法四、 原理溶血空斑試驗是體外檢測B淋巴細胞產(chǎn)生抗體能力的一種方法，其原理是用綿羊紅細胞（SRBC）免疫小鼠，取此小鼠脾臟制成脾細胞懸液（含抗體形成細胞），與一定量的SRBC混合后加入瓊脂凝膠中，于37作用下，抗體形成細胞釋放出抗SRBC抗體（即溶血素），在補體的參與下，能使抗體形成細胞周圍的SRBC溶解，從而在每一個抗體形成細胞

53、周圍，形成肉眼可見的溶血空斑，每個空斑均代表一個抗體形成細胞，空斑的大小表示抗體形成細胞產(chǎn)生抗體的多少，空斑的數(shù)量反映抗體產(chǎn)生能力的強弱。五、 應(yīng)用由于溶血空斑試驗具有特異性高、篩選力強、可直接觀察等優(yōu)點，故可用于判定免疫功能的指標，觀察免疫應(yīng)答的動力學變化，并可進行抗體種類及亞類的研究。在獸醫(yī)學實踐中，該方法可用于獸藥篩選、療效分析與疫苗質(zhì)量評價。四、材料與試劑1. 耗材：平皿、吸管、刻度離心管、注射器、錐形瓶、剪子、鑷子、血球計數(shù)板，200目不銹鋼網(wǎng)，1ml注射器；2. 儀器：溫箱、水浴鍋、離心機、顯微鏡、高壓鍋、冰箱；3. 動物：清潔級小鼠20只/班,綿羊1只；豚鼠2只。4. 試劑：生理

54、鹽水，PBS，磷酸氫二鈉（NaHPO4·12H2O）, 磷酸二氫鉀（KH2PO4）, NaCl,蒸餾水，Hanks液，小牛血清，瓊脂，補體。5. 阿氏溶液（Alsevers solution）： 葡萄糖 2.05克 檸檬酸鈉（5H2O） 0.8克 氯化鈉 0.42克 檸檬酸 0.55克 蒸餾水 100毫升充分溶解后過濾，分裝成小瓶，每瓶20ml，高壓蒸汽滅菌15-20分鐘，冷卻后4保存?zhèn)溆?。五、實驗準?. SRBC懸液 取綿羊血，用無菌生理鹽水洗三次，每次2000r/min離心5min, 最后取壓積紅細胞，懸于滅菌PBS中，調(diào)整細胞濃度為2×109個/ml2. 0.1mo

55、l/L pH7.2 PBS 磷酸氫二鈉（NaHPO4·12H2O）3.71g,磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.43g,NaCl7.2g,溶于1000ml蒸餾水中。3. 底層和頂層瓊脂底層瓊脂：1.4%瓊脂。用PBS配置1.4%的瓊脂糖 頂層瓊脂：0.7%瓊脂。用PBS配置1.4%的瓊脂糖 4. 補體（即無菌豚鼠血清） 用PBS 1：10稀釋六、實驗步驟與方法1. 免疫小鼠 取2×109個/ml的SRBC懸液，五倍稀釋到4×108個/ml的SRBC懸液，腹腔注射，每只小鼠接種1ml。2. 脾細胞懸液：免疫4天后的小鼠拉頸處死，取出脾，用Hanks液漂洗一次后，放入含有10%小牛血清Hanks液的平皿中，然后置200目不銹鋼網(wǎng)上，用1ml注射器針芯研磨成單細胞懸液，用Hanks液洗兩次（在冰浴中進行），每次均作離心