基因芯片技術基礎知識(概念、制備、雜交、應用及發(fā)展方向)上課講義

1、HGP生物科學正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學。最明顯的一個例子就是目前正在進行的 （human genome project ），最終要搞清人類全部基因組的 30 億左右堿基對的序列。除了 人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物（ model organism ）已經或正在被大規(guī) 模測序， 如大腸桿菌、 啤酒酵母、 秀麗隱桿線蟲以及中國和日本科學家攻關的水稻基因組計 劃。但單純知曉生物基因組序列一級結構還遠遠不夠， 還必須了解其中基因是怎樣組織起來 的，每個基因的功能是什么， 又是怎樣隨發(fā)育調控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時空域中 展開其表達譜的， 即我們正由結構基因組時代邁入功能基因組時代

2、。 隨著這個功能基因組學 問題的提出（后基因組時代，蛋白組學） 1 ，涌現(xiàn)出許多功能強大的研究方法和研究工具， 最突出的就是細胞蛋白質二維凝膠電泳（ 2-D-gel ）（及相應的質譜法測蛋白分子量）和生物 芯片（ Biochip ）技術 2 。一什么是基因芯片生物芯片，簡單地說就是在一塊指甲大?。?cm 3）的有 多聚賴氨酸 包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、 硝酸纖維素膜 、 尼龍膜 等，但需經特殊處理。 作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表面衍生出羥基或氨基 （視所要固定的分子為核 酸或寡肽而定） 并與保護基建立共價連接； 作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸

3、附 帶負電荷的探針分子， 通常需包被以氨基硅烷或 多聚賴氨酸 等）將生物分子探針 （寡 核苷酸 片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可與目的分子（如基因）相互作用，交行 反應的固相表面， 在激光的順序激發(fā)下標記熒光根據實際反應情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射 譜征， CCD 相機或 激光共聚焦顯微鏡 根據其波長及波幅特征收集信號，作出比較和檢測， 從而迅速得出所要的信息。 生物芯片包括基因芯片、 蛋白質芯片、 組織芯片。 而基因芯片中， 最成功的是 DNA 芯片，即將無數(shù)預先設計好的寡 核苷酸 或 cDNA 在芯片上做成點陣，與樣 品中同源核酸分子雜交 3 的芯片。基因芯片的基本原理同芯片技

4、術中雜交測序（ sequencing by hybridization, SBH ）。 即任何線狀的單鏈 DNA 或 RNA 序列均可被分解為一個序列固定、 錯落而重疊的寡 核苷酸 ， 又稱亞序列( subsequence )。例如可把寡 核苷酸 序列 TTAGCTCATATG 分解成 5個 8 nt 亞 序列：(1) CTCATATG(2) GCTCATAT(3) AGCTCATA(4) TAGCTCAT(5) TTAGCTCA這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊 7個堿基。亞序列中 A、 T、C、G 4個堿基自由 組合而形成的所有可能的序列共有 65536 種。假如只考慮完全互補的雜交，那么

5、48個 8 nt亞序列探針中， 僅有上述 5個能同靶 DNA 雜交?？梢杂萌斯ず铣傻囊阎蛄械乃锌赡艿?n 體寡核苷酸探針與一個未知的熒光標記 DNA/RNA 序列雜交， 通過對雜交熒光信號檢測， 檢 出所有能與靶 DNA 雜交的寡 核苷酸 ，從而推出靶 DNA 中的所有 8 nt 亞序列，最后由計算 機對大量熒光信號的譜型( pattern )數(shù)據進行分析，重構靶 DNA 的互補寡 核苷酸 序列。二芯片類型一般基因芯片按其材質和功能，基本可分為以下幾類 4(一)元件型微陣列芯片1. 生物電子芯片2. 凝膠元件微陣列芯片3. 藥物控釋芯片(二 ) 通道型微陣列芯片1. 毛細管電泳 芯片2 .

6、PCR 擴增芯片3. 集成DNA分析芯片4. 毛細管電層析芯片（三）生物傳感芯片1光學纖維陣列芯片2白光干涉譜傳感芯片小鼠基因表達譜芯片（MGEC）附:目前國內基因芯片常見品種.（上海博星公司）芯片品種芯片點數(shù)MGEC-20S2000MGEC-40S4000MGEC-80S8000癌癥相關基因表達譜芯片 （CRGEC）分類芯片型號芯片點數(shù)肝癌相關基因表達譜芯片LiverC-16S1626LiverC-16D3252LiverC-9.5NS954LiverC-9.5ND1908肺癌相關基因表達譜芯片Lun gC-7.3S737Lun gC-7.3D1474人類基因表達譜芯片（HGEC）芯片品種芯

7、片點數(shù)HGEC-10S1024HGEC-10D2048HGEC-20S2048HGEC-20D4096HGEC-40S4096HGEC-40D8192HGEC-80S8192HGEC-80D16184三基因芯片的制備芯片種類較多，制備方法也不盡相同，常見的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合 成30nt左右，噴印法可以合成 40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產率僅20% ;噴印法可達99%以上，合成3

8、0nt產率可達74%，從這個意義上說噴印法 特異性應比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點樣法較簡單，只需將預先制備好的寡 核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點于經特殊處理的玻璃片 或其它材料上即可。1原位光蝕刻合成5-7寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術是由 Asymetrix公司開發(fā)的，采用 的技術原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護，然后一個5'端保護的核苷酸單體連接上去，這個過程反復進行直至合成在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產出高密度的陣列， 指數(shù)增長。某一含n

9、個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4 xn個化學步驟能合成出4n個可能結構。 例如：一個完整的十 核苷酸 通過32個化學步驟， 8個小時可能合成 65,536 個探針。目前美國 Affymetrix 公司已有同時檢測 6,500 個已知人類基因的 DNA 芯片，并且正在制 備含 500,000-1,000,000 個寡 核苷酸 探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研 究的經費約 100 萬美元，目前產品尚未公開投放市場發(fā)揮經濟效益，但已有許多公司及研究 機構與其簽約購買其產品。 該產品不僅可用于基因表達分析和基因診斷等， 而且在大規(guī)模藥 物開發(fā)方面也具有誘人的前景。 Affymetrix 的

10、大部分產品將在 98 年底全面投放市場。屆時， 在其產品被廣泛采用的同時， 其所有的研究投入將變成巨大的利潤。 其它公司產品也正在從 實驗室技術研究走向開發(fā)應用。目前，用于分子診斷的 DNA 芯片不僅已可用于檢測愛滋病 病毒基因還可用于囊性纖維化（ CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關基因的基因診斷。鑒于光 刻設備技術復雜， 只能有專業(yè)化公司生產， 加之成本高及合成效率不高的問題， 因此有待進 行以下研究：對光刻技術進行改進，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技術，如噴印合成技術，該技術既能進行原位合成又能進行非原位合成。另一方法是光導原位合成法。 具體方法是在經過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（

11、linker ），其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask ）保護不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護基團， 游離羥基，利用化學反應加上第一個 核苷酸 ，所加 核苷酸 種類及在芯片上的部位預先設定， 所引入的 核苷酸 帶有光敏保護基團， 以便下一步合成。 然后按上述方法在其它位點加上另外 三種 核苷酸 完成第一位 核苷酸 的合成，因而 N 個核苷酸 長的芯片需要 4N 個步驟。每一個獨 特序列的探針稱為一個feature，這樣的芯片便具有4N個feature，包含了全部長度為 N的核苷酸 序列。這種原位直接合

12、成的方法無須制備處理克隆和 PCR 產物，但是每輪反應所需 設計的 光柵則是主要的經費消耗。運用這種方法制作的芯片密度可高達10 6探針/平方厘米，即探針間隔為 5 10 g，但只能制作II型DNA芯片。見圖一。ChiptliLtf"A- minkIJCi ivjI r/Jd >Ul I 曲 c：CtiupluiifRen|S?niACATC MTrAACGeCCG ATGCTAGCATTAGAGCT GCGAAATCTTTAGGGCT VTAAfreMOftAAAATTe CCCTTAGAGGAATCTCCyW/ing CiMjpliflC Rcrapmclighi ；k i

13、j vamlPb rl 皿I、13 in tikldsynl I心 i* ef6 )llUlKtClKllkN5RcpaGcdi Synthcik CyclesNuckoiide Key- AC r G T 72原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個芯片上移動并根據芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學試劑。3點樣法 點樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。點樣分子可以

14、是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點樣的方法將寡 核苷酸 分子點樣于化學處理后的載玻片上， 經一定的化學方法處理非干燥后， 寡 核苷酸 分子 即固定于載玻片上，制備好的 DNA 芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費時費力，不適于 大規(guī)模 DNA 芯片制作，因而實現(xiàn)自動化點樣就顯得尤為重要。有的研究者用 多聚賴氨酸 包 被固相支待物玻片， 經過分區(qū)后用計算機控制的微陣列點樣機按照預先設計順序點上核酸分 子，點樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法， 與其寡核苷酸微芯片相比。 DNA 芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量 化，分類PCR產物

15、。有的研究者將玻片上覆蓋 20 pm厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物， 采用機械刻寫或光刻的方法在其表面劃上網格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠， 以實現(xiàn) DNA芯片分區(qū)，單元大小為 40 >40 pm或100 X100 pm間隔分別為50 pm和100 pm。 然后將化學方法合成的寡 核苷酸探針自動化點樣于各個單元內而制成 DNA 芯片，點樣速度 可達 2000 單元 /秒。其裝置采用的機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印針的打印 /噴印頭；一個減震底座， 上面可放內盛探針的多孔板和多個芯片。 根據需要還可以有溫度和濕度 控制裝置、針洗滌裝置。打印 /噴印針將探針從多

16、孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接 打印時針頭與芯片接觸， 而在噴印時針頭與芯片保持一定距離。 打印法的優(yōu)點是探針密度高， 通常1平方厘米可打印 2,500個探針。缺點是定量準確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使 用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準確，重現(xiàn)性好，使用壽命長。缺點是噴印的斑點大，因 此探針密度低，通常 1平方厘米只有 400點。國外有多家實驗室和公司研究開發(fā)打印/噴印設備，目前有一些已經商品化。 軍事醫(yī)學科學院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印 /噴印技術進行生物芯片的研究和開發(fā)，預計 2年內將有用于實驗室研究或臨床診斷的基因芯片產品問世。見圖Robot pi petter4

17、電子芯片8-10電子芯片是由美國N anogen公司開發(fā)的，目前國內清華大學和復旦大學 也在開發(fā)這一技術。這種芯片為帶有陽電荷的硅芯片、芯片經熱氧化，制成1mm ximm的陣列、每個陣列含多個微電極，在每個電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場作用下生物素標記的探針即可結合在特定電極上。電子芯片最大特點是雜交速度快，可大大縮短分析時間。制備復雜、成本高是其不足。5三維芯片11-12三維芯片是由美國的 Packard、摩托羅拉、Argonne國家實驗室三家機 構與俄羅斯Engelhardt分子生物學研究所合作開發(fā)的一種芯片技術。三維生物芯片實質上 是一

18、塊顯微鏡載玻片，其上有10,000個微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用于靶 DNA ,RNA和蛋白質的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用3cm長的微型玻璃毛細管將待測樣品加到凝膠條上。每個毛細管能把小到0.2nl的體積打到凝膠上。以上幾家機構合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個優(yōu)點。一是凝膠的三維化能加進更多的已知物質，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時進行擴增與檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進行 PCR擴增，再把樣品加到芯片上，因此需要進行許多額外操作。本芯 片所用凝膠體積很小。使PCR擴增體系的體積減小1,000倍（總體積約納升級），從而節(jié)約了每個反應所用的

19、 PCR酶（約減少100倍）。三是以三維構象形式存在的蛋白和基因材料可 以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進行免疫測定，受體-配體研究和蛋白組分析。6流過式芯片（flow-thru chip ） 13 Cene Logic正在開發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀微通道，Cene Logic設計及合成特定的寡核苷酸探針，結合于微通道內芯片的特定區(qū)域。從待測樣品中分離 DNA或RNA并對其進行熒光標記，然后，該樣品流過芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補的核酸，采用Cene Logic's信號檢測系統(tǒng)分析結果。 流通式芯片用于高通量分析已知基因的變化，其特定在于敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增

20、大，流過式芯片可監(jiān)測稀有基因表達的變化；速度快：微通道加速了雜交反應， 減少了每次檢測所需時間；價格降低：由于采用了特殊的共價化學技術將寡 核苷酸吸附于微通道內， 使 每一種流過芯片可反復使用多次，從而使其成本降低。四基因芯片樣品制備一般說來應用 DNA芯片進行實驗包括5個過程：生物學問題的提出和芯片設計；樣品制備；生物雜交反應；結果探測；數(shù)據處理和建模。1 樣品制備。一般所需 mRNA的量是以一張表達譜芯片需要 3用mRNA計算的不同組織抽提3 10mRNA所需組織量器官/組織*提取3用mRNA所需組織量（克）提取10 （jgmRNA 所需織量（克）總RNA得率單位:毫克RNA/克組織mRN

21、A所占百分比%成人正常組織肝0.20830.69441.80 - 1.80 mg/g0.80成人正常組織腦缺數(shù)據缺數(shù)據1.30 - 1.30 mg/g缺數(shù)據成人正常組織肺0.30001.00001.00 - 1.00 mg/g1.00成人正常組織心0.50001.66670.60 - 0.60 mg/g1.00成人正胃0.18520.61732.70 - 2.70 mg/g0.60常組織成人正常組織喉0.31251.04171.20 - 1.20 mg/g0.80病理組織結腸癌0.25210.84031.70 - 1.70 mg/g0.70病理組織1=1=1 J i=r'冃癌0.431

22、71.43880.50 - 0.50 mg/g1.39病理組織空腸腺癌0.35711.19051.40 - 1.40 mg/g0.60病理組織直腸癌0.16040.53481.70 - 1.70 mg/g1.10病理組織肝癌0.11160.37203.84 - 3.84 mg/g0.70病理組織肺癌0.12820.42742.00 - 2.00 mg/g1.17考慮到個體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應在上述基礎上增加1-2倍。2樣本采集過程關鍵點.組織標本采集操作建議規(guī)程，（取標本所需關鍵器材和處理要求）鋁箔經DEPC水浸泡過夜，78 °C烘干，高壓滅菌后

23、烘干1.5 ml微離心管15 ml聚丙烯離心管市場有售RNAase-Free 的相應規(guī)格離心管標簽紙記號筆樣品登記表由客戶指定專人填寫液氮罐應常備液氮罐，并保證液氮的來源取材部位的病理切片由客戶提供1-2張注:以下步驟1 - 5應在冰上進行且不超過15分鐘，超過時間會導致樣品的RNA降解。對腫瘤組織的取材，要求盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術切除的整個或部分前列腺，可能要根據冰凍切片報告的結果來判定要進行研究的取材部位。1離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，易V除結締組織和脂肪組織。胃、腸組織應剪除外膜；肝、腎、脾應剪除門部血管神經，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應

24、將 周圍的腫瘤組織切除干凈）。2在RNase-Free 0.9 %生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。3用鋁箔包裹組織，或用 5ml凍存管裝載組織（但最好統(tǒng)一采用鋁箔）。用記號筆在鋁箔或 凍 存管外表寫明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。4填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙（標簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉入便攜式液氮罐5保留1-2張取材部位的病理切片。五生物芯片雜交待分析基因在與芯片結合探針雜交之前必需進行分離、 擴增及標記。 根據樣品來源、 基 因含

25、量及檢測方法和分析目的不同， 采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然，常規(guī)的 基因分離、 擴增及標記技術完全可以采用， 但操作繁瑣且費時。 高度集成的微型樣品處理系 統(tǒng)如細胞分離芯片及基因擴增芯片等是實現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。 為了獲得基因 的雜交信號必須對目的基因進行標記， 目前采用的最普遍的熒光標記方法與傳統(tǒng)方法如體外 轉錄、 PCR 、逆轉錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不 同來源樣品的平行分析。 用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結合于芯片上目的基因的 熒光信號，通過計算機處理即可給出目的基因的結構或表達信息。雜交條件的選擇與研究目的有關， 多態(tài)

26、性分析或者基因測序時， 每個 核苷酸 或突變位點 都必須檢測出來。 通常設計出一套四種寡聚 核苷酸 ，在靶序列上跨越每個位點， 只在中央位 點堿基有所不同， 根據每套探針在某一特點位點的雜交嚴謹程度， 即可測定出該堿基的種類。這有利于增加檢測如果芯片僅用于檢測基因表達，只需設計出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚 核苷酸 即可。表達檢測需要長的雜交時間， 更高的嚴謹性， 更高的樣品濃度和低溫度，的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測， 要鑒別出單堿基錯配，需要更高的雜交嚴謹性和更短的時間。此外， 雜交反應還必須考慮雜交反應體系中鹽濃度、 探針 GC 含量和所帶電荷、 探針與 芯片之間連接臂的長

27、度及種類、 檢測基因的二級結構的影響。 有資料顯示探針和芯片之間適 當長度的連接臂可使雜交效率提高 150倍 9。連接臂上任何正或負電荷都將減少雜交效率。 由于探針和檢測基因均帶負電荷， 因此影響他們之間的雜交結合， 為此有人提出用不帶電荷 的肽核酸（ PNA ）做探針 9。雖然 PNA 的制備比較復雜，但與 DNA 探針比較有許多特點， 如不需要鹽離子， 因此可防止檢測基因二級結構的形成及自身復性。 由于 PNA-DNA 結合更 加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯配基因的檢測。六 基因芯片檢測原理雜交信號的檢測是 DNA 芯片技術中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，

28、 如熒光顯微鏡 、隱逝波傳感器、 光散射表面共振、 電化傳感器、 化學發(fā)光、 熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于 DNA 芯片。由于 DNA 芯片本身的結構及性 質，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模 DNA 芯片由于其面積小，密度大， 點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用 光電倍增管 或冷卻的電荷偶連照相機 (charged- coupled device camera ，CCD) 攝像機等弱光信號探測裝置。此外，大多數(shù)DNA 芯片雜交信號譜型除了分布位點以外還需要確定每一點上的信號強度， 以確定是完全雜交還是不完全 雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應也是非常重要的。 雜

29、交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交 信號產生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。由于所使用的標記物不同， 因而相應的探測方法也各具特色。 大多數(shù)研究者使用熒光標 記物，也有一些研究者使用生物素標記，聯(lián)合抗生物素結合物檢測 DNA 化學發(fā)光。通過檢 測標記信號來確定 DNA 芯片雜交譜型。1熒光標記雜交信號的檢測方法使用熒光標記物的研究者最多， 因而相應的探測方法也就最多、 最成熟。 由于 熒光顯微 鏡可以選擇性地激發(fā)和探測樣品中的混合熒光標記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨 率，特別是當 熒光顯微鏡 中使用了共焦激光掃描時， 分辨能力在實際應用中可接近由數(shù)值孔 徑和光波長決定的空間分辨率，

30、而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為 DNA 芯片進一步 微型化提供了重要的檢測方法的基礎。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡 ( epifluoescence microscope )基礎上發(fā)展起來的， 包括激光掃描 熒光顯微鏡 、激光共焦掃描顯微鏡、 使用了 CCD 相機的改進的 熒光顯微鏡 以及將 DNA 芯片直接制作在光纖維束切面上并結合 熒光顯微鏡 的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象 以熒光物質標記，如 熒光素或麗絲膠( lissamine )等，雜交后經過 SSC 和 SDS 的混合溶液或 SSPE 等緩沖液 清洗。( 1)激光掃描 熒光顯微鏡探測裝置比較典型。

31、方法是將雜交后的芯片經處理后固定在計算機控制的二維傳動平臺 上，并將一物鏡置于其上方， 由氬離子激光器產生激發(fā)光經濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面， 激發(fā)熒光標記物產生熒光，光斑半徑約為5- 10 g。同時通過同一物鏡收集熒光信號經另一濾波片濾波后， 由冷卻的 光電倍增管 探測， 經模數(shù)轉換板轉換為數(shù)字信號。 通過計算機控制 傳動平臺 XY 方向上步進平移， DNA 芯片被逐點照射，所采集熒光信號構成雜交信號譜 型，送計算機分析處理，最后形成20 口象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質量較好，適用于各種主要類型的 DNA 芯片及大規(guī)模 DNA 芯片雜交信號檢測， 廣泛應用于基因表達、 基因診斷等方

32、面研究。(2)激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描 熒光顯微鏡 結構非常相似， 但是由于采用了共焦技術因 而更具優(yōu)越性。 這種方法可以在熒光標記分子與 DNA 芯片雜交的同時進行雜交信號的探測， 而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix 公司的SP AForder 等人設計的 DNA 芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA 分子溶液放在 樣品地中，芯片上合成寡 核苷酸 陣列的一面向下，與 樣品池 溶液直接接觸，并與 DNA 樣品 雜交。當用激發(fā)光照射使熒光標記物產生熒光時，既有芯片上雜交的DNA 樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中 DNA 所發(fā)出

33、的熒光，如何將兩者分離開來是一個非常重要的問題。而共 焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率， 可以在接受芯片表面熒光信號的同時， 避開 樣品池 中熒 光信號的影響。一般采用氬離子激光器( 488nm )作為激發(fā)光源，經物鏡聚焦，從芯片背 面入射， 聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。 雜交分子所發(fā)的熒光再經同一物鏡收集， 并經濾 波片濾波， 被冷卻的 光電倍增管 在光子計數(shù)的模式下接收。 經模數(shù)轉換反轉換為數(shù)字信號送 微機處理， 成像分析。 在光電信增管前放置一共焦小孔， 用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外 的來自 樣品池 的未雜交分子熒光信號， 避免其對探測結果的影響。 激光器前也放置一個小孔 光闌以盡量縮

34、小聚焦點處光斑半徑， 使之能夠只照射在單個探針上。 通過計算機控制激光束 或樣品池 的移動， 便可實現(xiàn)對芯片的二維掃描， 移動步長與芯片上寡 核苷酸 的間距匹配， 在 時間長， 比較適合研究用。 現(xiàn)在 Affymetrix 公司已推出商業(yè)化樣機， 整套系統(tǒng)約 12 萬美元。幾分鐘至幾十分鐘內即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高， 掃描（ 3）采用了 CCD 相機的 熒光顯微鏡這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于 熒光顯微鏡 ，但是以 CCD 相機作為信號接收 器而不是 光電倍增管 ，因而無須掃描傳動平臺。 由于不是逐點激發(fā)探測， 因而激發(fā)光照射光 場為整個芯片區(qū)域，由 CC

35、D 相機獲得整個 DNA 芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激 光器作為激發(fā)光源， 由于激光束光強的高斯分布， 會使得光場光強度分布不均， 而熒光信號 的強度與激發(fā)光的強度密切相關， 因而不利于信號采集的線性響應。 為保證激發(fā)光勻場照射， 有的學者使用高壓汞燈經濾波片濾波， 通過傳統(tǒng)的光學物鏡將激發(fā)光投射到芯片上， 照明面 積可通過更換物鏡來調整； 也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源， 使用光纖維束與 透鏡結合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈 50o 角入射。由于采用了 CCD 相機，因而大大提高 了獲取熒光圖像的速度， 曝光時間可縮短至零點幾秒至十幾秒。 其特點是掃描時間短， 靈敏 度和分辨

36、率較低，比較適合臨床診斷用 14.（4）光纖傳感器有的研究者將 DNA 芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端） ，光纖維束的另一端（近 端）經特制的耦合裝置耦合到 熒光顯微鏡 中。光纖維束由 7 根單模光纖組成。每根光纖的直 徑為200呵,兩端均經化學方法拋光清潔。化學方法合成的寡 核苷酸探針共價結合于每根光纖的遠端組成寡 核苷酸 陣列。 將光纖遠端浸入到熒光標記的靶分子溶液中與靶分子雜交， 通 過光纖維束傳導來自 熒光顯微鏡 的激光（ 490urn ），激發(fā)熒光標記物產生熒光，仍用光纖維 束傳導熒光信號返回到 熒光顯微鏡 ，由 CCD 相機接收。每根光纖單獨作用互不干擾，而溶 液中的熒光信號基

37、本不會傳播到光纖中， 雜交到光纖遠端的靶分子可在 90的甲酸胺（ for mamide ）和 TE 緩沖液中浸泡 10秒鐘去除，進而反復使用。這種方法快速、便捷，可實時 檢測 DNA 微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因 而不便于制備大規(guī)模 DNA 芯片，有一定的應用局限性。2.生物素標記方法中的雜交信號探測以生物素 ( biotin )標記樣品的方法由來已久， 通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結合物(如結合化學發(fā)光底物酶、熒光素等) ，再利用所結合大分子的特殊性質得到最 初的雜交信號， 由于所選用的與抗生物素結合的分子種類繁多， 因而檢測方法也更趨多樣

38、化。 特別是如果采用 尼龍膜 作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于 DNA 芯片雜交將受到 很大的限制， 因為在 尼龍膜 上熒光標記信號信噪比較低。 因而使用 尼龍膜 作為固相支持物的 這些研究者大多是采用生物素標記的。目前應用較多的是美國 General Scanning 公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng) (ScanArray 3 000) ，采用激光共聚焦掃描原理進行熒光信號采集， 由計算機處理熒光信號， 并對每個點的 熒光強度數(shù)字化后進行分析。近期又開發(fā)出了 ScanArray 5000 ，其掃描精度和功能有較大 的提高。七 結果的分析樣品在被測定前，首先要經過消化，使待測組織細胞中的

39、 DNA 或 RNA 釋放出來，在經 過適當?shù)臄U增后，以熒光標記物標記，放入基因芯片自動孵育裝置( Fluidics Station )中， 由其自動控制反應的時間、溫度以及緩沖液的配比等反應條件，進行雜交， 這一過程， 僅需 要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對基因芯片進行 “讀片 ”，即應用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對 基因芯片表面的每個位點進行檢測。 這種顯微鏡， 將聚焦的平面設定為芯片的表面， 因此可 以檢測結合到芯片表面位點的樣品片斷的熒光標記， 而待測樣品中未與芯片上探針結合的熒 光標記物， 則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。樣品與探針的錯配是影 響雜交反應結果的重要因素，

40、但由于樣品與芯片上的探針正確配對時產生的熒光信號要比錯 配時強的多，因此，通過對信號強度的分析，就可以區(qū)分正確與錯誤的配對。為了使結果的檢驗更加簡便和快速， Affymetrix 的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣 列掃描儀和專用的基因芯片工作站， 對一幅包含數(shù)萬個探針位點的基因芯片圖樣的分析， 僅 需要數(shù)分鐘的時間。 這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時內， 就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才 能完成的幾萬乃至幾十萬次雜交分析試驗。八 基因芯片的應用（一）基因表達分析 基因芯片具有高度的敏感性和特異性， 它可以監(jiān)測細胞中幾個至幾千 個 mRNA 拷貝的轉錄情況。 與用單探針分析 mRNA 的點雜交技術不

41、同， 基因芯片表達探針 陣列應用了大約 20對寡核苷酸 探針來監(jiān)測每一個 mRNA 的轉錄情況。每對探針中，包含一 個與所要監(jiān)測的 mRNA 完全吻合和一個不完全吻合的探針（圖2），這兩個探針的差別在于其中間位置的 核苷酸 不同。這種成對的探針可以將非特異性雜交和背景訊號減小到最低的水 平，由此我們就可以確定那些低強度的 mRNA 。目前， Affymetrix 公司已經生產出 Hugene FL 、 Mu6500 （含有小鼠 6 500個基因）、 Ye6100 （含有酵母 6 100個基因）等基因芯片 成品。1 分析基因表達時空特征。英國劍橋大學 Whitehead 研究所的 Frank C

42、.P. Holstege 等 人，應用含有酵母基因組的基因芯片， 深入研究了真核細胞基因組的調節(jié)周期。 應用基因組 水平的表達分析，監(jiān)測那些表達受轉錄起始機制的關鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶 II、主要的轉錄因子 TFIID和SAGA染色體修飾復合物等均在基因的表達中有自己特定的作 用位點 15 。通過本試驗， 研究人員揭示了： （1）基因特異性的轉錄因子對表達的調控作用。 （2）細胞在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點的協(xié)同調節(jié)作用的全新機制。（3）信號轉導通路的最終作用位點， 在最初的幾步中就可以確定。 以此試驗為基礎， 研究人員進一步繪制 出了酵母基因組控制圖， 并由此分析出了各種

43、調節(jié)因子在基因上不同的作用位點和其作用的 分子機制。美國 Stanford 大學的 V.R.Iyer 等人16，對成纖維細胞中與細胞增生和損傷修復有關的 基因進行了分析。首先，他們用成纖維細胞中的 8600個基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過與 mRNA 反轉錄形成的 cDNA 的雜交反應， 可以判斷出該基因的活性。 在試驗中， 成纖維細胞被置于無營養(yǎng)的環(huán)境中， 使絕大部分基因的活性關閉， 兩天后，加入10% 的血清， 24小時內，分 6個不同的時間點，觀察基因的活化情況。試驗結果表明，在所有被監(jiān)測的基因中，約有 500個基因最為活躍，而使細胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化

44、的是那些轉錄調控基因。在活化的基因中，有28 個基因共同作用，控制細胞的增殖；8個與免疫反應的激活有關； 19 個與血管重建有關；另有許多基因，與血管新生密切相關。 在腫瘤細胞中， 基因的表達與正常的細胞存在著明顯的差異。 通過基因芯片繪出基因表達的 時空圖譜，有助于人類認識生命活動過程和特征。2 基因差異表達檢測 17 生命活動中基因表達的改變是生物學研究的核心問題。 理解人類 基因組中 10萬個不同的基因功能，監(jiān)測某些組織、細胞不同分化階段的差異基因表達( diff erential gene expression ，DGE )十分重要。對差異表達的研究， 可以推斷基因與基因的 相互關系，

45、細胞分化中基因 “開啟”或“關閉 ”的機制；揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸的 內在聯(lián)系。目前 DGE 研究方法主要有表達序列標簽( ESTs )測序、差減克隆( subtractiv e cloning )、差異顯示( differential display )、基因表達系列分析 (serial analysis of gen e expression, SAGE) 。而 cDNA 微陣列雜交技術可監(jiān)測大量 mRNA 的轉錄，直接快速地 檢測出極其微量的 mRNA ，且易于同時監(jiān)測成千上萬的基因，是研究基因功能的重要手段 之一。 Rihn BH 等利用基因芯片檢測胸膜間皮瘤與正常細胞間比較

46、了 6500 個基因，發(fā)現(xiàn)了 300 多個差異基因的表達。 其中幾個典型基因的表達經 RT-PCR 進行定量后， 可作為胸膜間 皮瘤診斷的標記物(Markers ) 18。Sgroi19報告DNA芯片結合激光捕獲顯微切割技術(I aser capture microdissection )用于乳癌浸潤期和轉移期及正常細胞的基因表達譜 ( gene expression profiIes )差異研究，結果被 定量 PCR 和免疫組化所證實。差異表達有助于早 期發(fā)現(xiàn)瘤細胞 3萬個基因與正常細胞的區(qū)別， 有助于了解瘤細胞的發(fā)生、 浸潤、轉移和藥敏。 最近，美國毒物化學研究所( CIIT ) 和國家環(huán)

47、境健康科學研究所( NIEHS )正計劃在一張 玻片上建立 8 700個小白鼠 cDNA 芯片，用于肝癌的研究。我國也已成功研制出能檢出 41 000 種基因表達譜的芯片。美國 Stanford 大學的 David Botstein 利用 cDNA 微陣列芯片， 對乳腺癌細胞的基因表達進行了分析， 發(fā)現(xiàn)其基因表達水平明顯低于正常細胞。 利用基因芯 片對表達進行分析，在一次試驗中可以獲取相當于在60 余萬次傳統(tǒng)的 Northern 雜交中所獲 得的關于基因表達的信息。 通過這種實驗方法， 可以建立一種全新的腫瘤分類學方法， 即依 據每個腫瘤細胞中的基因表達情況對腫瘤細胞進行分類。 基因芯片技術在

48、分析基因的表達中 具有不可比擬的優(yōu)勢。3 發(fā)現(xiàn)新基因 Moch 等利用腫瘤微陣列芯片（ 5 184 個 cDNA 片段）發(fā)現(xiàn)了腎細胞癌的 腫瘤標志物基因， 并于正常細胞進行比較。 在532 份標本中檢測到胞漿纖維Vimentin 的表達基因，陽性率為51%61%20。追蹤觀察，有 Vimentin表達的患者，預后極差。人類大量 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源， 數(shù)據庫中 400 000個 ESTs 代表了所有人類基因， 成千上萬的 ESTs 微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。 這將大大地加速人 類基因組的功能分析 21。定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、 探

49、索疾病原因及機理、 發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療 靶等方面是很有價值的。如該技術在炎癥性疾病類風濕性關節(jié)炎（RA）和炎癥性腸病（IBD）的基因表達研究中，由RA或IBD組織制備探針，用 Cy3和Cy5熒光素標記，然后與靶CDNA微陣列雜交，可檢測出炎癥疾病誘導的基因如TNF- a IL或粒細胞集落刺激因子，同時發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如 HME 基因和黑色素瘤生長刺激因子。 Schena 等人22報道 了 CDNA 的微陣列在人類基因表達監(jiān)測、 生物學功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應用。 采用含 1, 046 個已知序列的 CDNA 微陣列，用高速機器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測不同 基因表達， 在

50、一定的實驗條件下， 不同表達模式的陣列成分通過序列分析鑒定其特征。 該方 法較以往常用的方法敏感 10倍以上，檢測限度為 1:500,000（wt/wt） 總人體 mRNA 。在培養(yǎng) T 細胞熱休克反應的測定中，發(fā)現(xiàn) 17個陣列成分的熒光比較明顯改變，其中1 1個受熱休克處理的誘導， 6個呈現(xiàn)中度抑制，對相應于 17個陣列成分的 CDNA 測序發(fā)現(xiàn) 5個表達最高的成 分是 5種熱休克蛋白， 1 7個克隆中發(fā)現(xiàn) 3個新序列。另外，在佛波酯誘導檢測中 23，發(fā)現(xiàn)有 6個陣列成分信號增強超過 2倍，測序及數(shù)據庫比較揭示有 5個已知的，誘導表達最高的兩個 是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-啟1 ,有一

51、個是未知的。 這4個新基因的表達水平均相對較 低，僅呈現(xiàn) 2倍的誘導。 Northern 雜交結果證實了微陣列的結果。進一步檢測了人的骨髓、4種組織中檢測出 1 5種熱休克和腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調節(jié)基因的表達， 佛波酯調節(jié)基因的表達，其表達水平與 Jurkat 細胞中相應成分的表達水平密切相關如在四種組織中表達水平最高的兩個基因3-actin和細胞色素C氧化酶在Jurkat細胞中的表達水平也很高。 上述實驗提示在缺乏任何序列信息的條件下， 微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達檢 測。目前，大量人類 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據庫中 400,000 個 ESTs

52、 代表了所有人類基因， 成千上萬的 ESTs 微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工 具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。4 大規(guī)模 DNA 測序 人類基因組計劃的實施促進了高效的、自動化操作的測序方法 的發(fā)展。芯片技術中雜交測序( sequencing by hybridization, SBH )技術及鄰堆雜交( co ntiguous stacking hybridization, CSH )技術即是一種新的高效快速測序方法 24-26 。用含 65 536個8聚寡核苷酸 的微陣列，采用 SBH 技術，可測定 200 bp 長 DNA 序列，采用 67 1 08 864個13聚

53、寡核苷酸的微陣列，可對數(shù)千個堿基長的DNA測序。SBH技術的效率隨著微陣列中寡 核苷酸 數(shù)量與長度的增加而提高， 但微陣列中寡 核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高 了微陣列的復雜性，降低了雜交準確性。 CSH 技術彌補了 SBH 技術存在的弊端， CSH 技 術的應用增加了微陣列中寡 核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行較長的 DNA 測 序。計算機模擬論證了 8聚寡核苷酸微陣列與 5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當于 13聚寡核苷酸 微陣列的作用，可測定數(shù)千個 核苷酸 長的 DNA 序列26 。 Dubiley 等人26將合成的 10聚寡核 苷酸固定于排列在載片表面的 0.1 >0.1 X0.

54、02mm或1 X1 X0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚 寡核苷酸 微陣列，先用分離微陣列( fractionation chips )進行單鏈 DNA 分離，再用測序微 陣列(sequencing chips )分析序列，后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA 雜交及與鄰堆的 5聚寡核苷酸連接等技術。該方法可用于含重復序列及較長序列的 DN A 序列測定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測序的準確率達99% 以上。正如 NIH 首腦 Harold Varmus 在美國細胞生物學 1 998年年會上所說： “在基因芯片的幫助 下，我們將能夠監(jiān)測一個細胞乃至整個組織中所

55、有基因的行為?！?二) 基因型、基因突變和多態(tài)性分析在同一物種不同種群和個體之間， 有著多種不同的基因型， 而這種不同， 往往與個體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關系。通過對大量具有不同性狀的個體的基因型進行比 較，就可以得出基因與性狀的關系。 但是， 由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個基因同時 決定的， 因此分析起來就十分困難， 然而基因芯片技術恰恰解決了這一問題， 利用其可以同 時反應數(shù)千甚至更多個基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關 系。美國 Stanford 大學的 E.A.Winzeler 等27 ，以兩種不同菌株的酵母（ S96 和 YJM789 ） 作

56、為實驗材料， 對控制酵母對放線菌酮的抗藥性的基因進行分析。 將含有酵母 150 000 個 D NA 片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉錄的 mRNA 分子雜交， S96 幾乎全部吻合， 而 YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個位點沒有雜交顯色。由于S96對放線菌酮有抗藥性而 YJM789 的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所 在。而后，通過對 S96 和 YJM789 雜交后產生的抗藥子代的遺傳標記的分析，進一步確定， 控制該抗藥性的基因位于 15號染色體，是一長約 57 000個堿基的片斷。美國國家人類基因 組研究室的 J.G.Hacia 等在 F

57、odor 研究小組的協(xié)助下 28，將基因芯片應用于雙色突變分析。 他們的分析對象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關的BRCA1 基因的外顯子 11。在擴增后，將 BRCA1 基因的外顯子 11置于含有熒光素 -12-UTP 的環(huán)境中進行體外轉錄反應，而 后將轉錄產生的 mRNA 與 BRCA1 外顯子 11芯片雜交， 4小時后，用藻紅蛋白染色。在觀察 時，用 488nm 的氬離子激光進行掃描，熒光染色位點呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點呈 現(xiàn)紅色。 應用雙色分析， 可以更為清楚的監(jiān)測未知樣品與標準鏈之間的競爭性雜交情況，進而分析該基因中的不同突變。通過對 15名患者 BRCA1 基因的觀察，有 14名患者在外顯子 1 1位點存在不同的突變。Hacia等：29在1.28 cm X1.28 cm的芯片上固定了 9.66 X104個長度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測乳腺癌基因BRCA1的e