與基因分離第三節(jié)cDNA文庫的構(gòu)建與篩選第四節(jié)根據(jù)差異

1、第一節(jié)第一節(jié)PCRPCR擴(kuò)增獲得目的基因或擴(kuò)增獲得目的基因或cDNAcDNA第二節(jié)基因組文庫的構(gòu)建與基因分離第二節(jié)基因組文庫的構(gòu)建與基因分離第三節(jié)第三節(jié)cDNAcDNA文庫的構(gòu)建與篩選文庫的構(gòu)建與篩選第四節(jié)根據(jù)差異表達(dá)獲得目的基因第四節(jié)根據(jù)差異表達(dá)獲得目的基因第五節(jié)基因的化學(xué)合成第五節(jié)基因的化學(xué)合成第五章第五章 目的基因的獲得目的基因的獲得 基因克隆的本質(zhì)是把某一目的基因克隆的本質(zhì)是把某一目的DNADNA片段通過無片段通過無性方式進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，而這一過程往往是通過載性方式進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，而這一過程往往是通過載體和寄主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。體和寄主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作：一般

2、而言，基因克隆包括四部分工作：1 1、目標(biāo)、目標(biāo)DNADNA片段的獲得；片段的獲得；2 2、克隆載體的構(gòu)建；、克隆載體的構(gòu)建；3 3、寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；、寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；4 4、重組體克隆的選擇和鑒定。、重組體克隆的選擇和鑒定。 目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒?。為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒?。大腸桿菌作為寄主進(jìn)行大腸桿菌作為寄主進(jìn)行DNADNA克隆的實(shí)驗(yàn)方案克隆的實(shí)驗(yàn)方案DNADNA片段片段的獲得的獲得載體構(gòu)建載體構(gòu)建細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化重組體重組體的鑒定的鑒定限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶消化切酶消化機(jī)械切割機(jī)械切割雙鏈

3、雙鏈c cDNADNA的合成的合成化學(xué)法化學(xué)法直接合成直接合成同聚物同聚物加尾加尾粘性末端粘性末端連接連接平末端平末端連接連接加接頭造成加接頭造成粘性末端粘性末端重組噬菌體重組噬菌體DNADNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體外包裝體外包裝進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)表型鑒定表型鑒定核酸雜交核酸雜交免疫學(xué)分析免疫學(xué)分析酶切鑒定酶切鑒定PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合

4、反應(yīng)必需的雙引物。第一節(jié)第一節(jié) PCR擴(kuò)增獲得目的基因或擴(kuò)增獲得目的基因或cDNA基于PCR的分離法（1）直接從基因組中擴(kuò)增提取基因組DNA作模板根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增適合擴(kuò)增原核生物基因。真核生物基因組含有內(nèi)含子！原核基因組部分原核基因組部分原核細(xì)胞原核細(xì)胞提取基因組提取基因組DNADNAPCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增基于PCR的分離法（2）從mRNA中擴(kuò)增: RT-PCR提取基因組 total RNA反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增適合擴(kuò)增真核生物基因。原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。目的基因目的基因 的引物的引物1 1反轉(zhuǎn)錄成目的基因反轉(zhuǎn)錄成

5、目的基因cDNAcDNA第一鏈第一鏈目的目的 基因基因cDNAcDNA第二鏈第二鏈PCRPCRmRNAmRNA目的基因目的基因 的引物的引物2 2基于PCR的分離法（3）同源序列克隆法依據(jù)：自然界的長期進(jìn)化中，一些蛋白質(zhì)的基因編碼序列保持著高度的保守性，在生物的種屬之間，基因編碼序列有著很高的同源性。方法：根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行RACE擴(kuò)增或結(jié)合DNA文庫進(jìn)行分離目的基因。RACE：根據(jù)已得到的不完整的：根據(jù)已得到的不完整的cDNA序列設(shè)計(jì)引序列設(shè)計(jì)引物對物對mRNA3端和端和5端進(jìn)行克隆，可獲端進(jìn)行克隆，可獲得全的得全的cDNA克隆克隆 。（。（RACE克隆的

6、意克隆的意義）義） cDNAcDNA末端的快速擴(kuò)增（末端的快速擴(kuò)增（RACERACE）1、根據(jù)基因編碼蛋白同源序列，或多個(gè)同源基因、根據(jù)基因編碼蛋白同源序列，或多個(gè)同源基因cDNA序列設(shè)計(jì)（簡并）引物，序列設(shè)計(jì)（簡并）引物，RT-PCR克隆核克隆核心序列心序列，測序。，測序。 2、根據(jù)核心序列，設(shè)計(jì)新的引物進(jìn)行、根據(jù)核心序列，設(shè)計(jì)新的引物進(jìn)行cDNA的的3端端和和5端的擴(kuò)增。端的擴(kuò)增。3、拼接拼接成成 cDNA全序列的信息，設(shè)計(jì)新的引物全序列的信息，設(shè)計(jì)新的引物擴(kuò)增擴(kuò)增全長全長cDNA序列。序列。經(jīng)典經(jīng)典RACERACE技術(shù)流程技術(shù)流程 3 RACE：由含有由含有oligo（dT）的接頭引物）

7、的接頭引物引發(fā)合成引發(fā)合成cDNA第一鏈，根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)第一鏈，根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)出上游引物，與出上游引物，與3引物擴(kuò)增第一鏈引物擴(kuò)增第一鏈cDNA，可得，可得到全長到全長cDNA的的3末端序列。末端序列。 5 RACE：先用先用oligo（dT）引發(fā)合成）引發(fā)合成cDNA第一鏈，然后在第一鏈第一鏈，然后在第一鏈cDNA的的3端加上端加上人工錨定序列，利用人工錨定序列，利用5錨定引物及錨定引物及3特異性引物特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到全長進(jìn)行擴(kuò)增，得到全長cDNA的的5末端序列。末端序列。經(jīng)典經(jīng)典RACERACE克隆原理克隆原理由含有oligo（dT）的接頭引物引發(fā)合成第一鏈cDNA根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)出5特異性引物與3引物擴(kuò)增第一鏈cDNA可得到全長cDN