細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基本操作

1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基本操作【細(xì)胞培養(yǎng)】一、細(xì)胞的復(fù)：非原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般凍存于液氮之中，需要培養(yǎng)時(shí)要先從液氮中取出使之復(fù)。細(xì)胞復(fù)的原則快速融化：必須將凍存在196液氮中的細(xì)胞快速融化至37，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。具體操作如下：1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.1、 將水浴鍋預(yù)熱至37C,并將含10%FBS勺培養(yǎng)液置于其中預(yù)熱；。1.2、 用75酒精擦拭紫外線照射30min 的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。1.3、 在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。2、取出凍存管及迅速解凍：2.1、 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。2.2、 從液氮罐

2、中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。2.3、 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化，約1-2min 后凍存管液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)。3、平衡離心 將細(xì)胞懸液吸到離心管中，10001500rpm離心3分鐘；4、制備細(xì)胞懸液吸去上清液，加入10 ml 培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，使細(xì)胞懸浮；5、細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞濃度以5X105/ml為宜。6、培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液吸到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37和5 CO2 的培養(yǎng)箱培養(yǎng)（略微擰松培養(yǎng)瓶蓋），換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。通常，除少數(shù)特別注明對(duì)DM

3、SO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有10-15ml （ 5 10 倍）新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題。二、細(xì)胞的傳代：培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗、代物逐步積累（可見(jiàn)到培養(yǎng)液變黃），而且細(xì)胞的生長(zhǎng)空間也受到限制，就會(huì)影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存。這時(shí)就需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過(guò)程就叫做傳 代。1、貼壁細(xì)胞的傳代具體操作如下：1.1、 傳代前準(zhǔn)備：1.1.1、 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37c水浴鍋 預(yù)熱。1

4、.1.2、 用75酒精擦拭雙手和經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)1.1.3、 正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。1.1.4、 點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。1.1.5、 準(zhǔn)備好將要使用的已滅菌的空培養(yǎng)瓶。1.1.6、 取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后能放入超凈臺(tái)。1.1.7、 從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞，注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞，并做好記錄。1.1.8、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶經(jīng)用75酒精擦拭后，再放入超凈臺(tái)。1.2、 胰蛋白酶消化：1.2.1、 將瓶蓋過(guò)酒精燈火焰消毒后，打開瓶蓋，靠近酒精燈，小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗2 3

5、次，沿壁（無(wú)細(xì)胞的一面）緩緩加入適量消化液（胰蛋白酶液），輕輕搖晃。注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37。1.2.2、 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。1.3、 吹打分散細(xì)胞：1.3.1、 棄去大部分消化液（僅留少量在瓶），并輕輕拍打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散，然后加入新鮮的培養(yǎng)液，再用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液（盡可能不要出現(xiàn)泡沫，否則對(duì)細(xì)胞有損傷1.4、 分裝稀釋細(xì)胞1.4.1、 將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。1.4.2、 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時(shí)計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生

6、長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5Xl05/ml。最后在瓶上做好標(biāo)記，如細(xì)胞代數(shù)、日期及姓名等。1.5、 繼續(xù)培養(yǎng)：1.5.1、 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2 小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25時(shí)為一個(gè)，占50為，占75時(shí)為。2、懸浮細(xì)胞的傳代懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。 當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺(jué)到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管，10001500rpm離心3分鐘，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3 滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中

7、培養(yǎng)（擰松培養(yǎng)瓶蓋）。三、細(xì)胞的凍存細(xì)胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細(xì)胞部形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害。1、具體操作如下：1.1、 從增值期到形成致密單層以前的細(xì)胞都可以用于凍存，但最好選擇對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，已長(zhǎng)滿的細(xì)胞凍存復(fù)后生存率低。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。1.2、 貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、離心（10001500rpm , 5min）收集，懸浮細(xì)胞經(jīng)離心收集；1.3、 大約106個(gè)細(xì)胞加入1ml凍存液（10%DMSO+90%血清），用吸管吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液；1.4、 加入到凍存管中，每個(gè)凍存管加1 1.5ml 的細(xì)胞懸液；密封；1.5、 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱及凍存日期；1.6、 將

8、凍存管直立放置于塑料盒或紙盒，管置于4半小時(shí)，然后置于-20 兩小時(shí)，再置于-70 兩小時(shí)，然后置于液氮上過(guò)夜；第二天將細(xì)胞置于液氮中；1.7、 記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄（凍存的細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等）。2、注意事項(xiàng)：2.1、 使用DMSO 前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO 對(duì)人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。2.2、 不宜將凍存細(xì)胞放置在0c-60 C這一溫度圍過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。2.3、 注意定期檢查液氮罐液氮量，及時(shí)添加。2.4、 細(xì)胞在液氮中貯存的時(shí)

9、間理論上是無(wú)限的。但為妥善起見(jiàn)，特別是很多未被凍存過(guò)的細(xì)胞在首次凍存后要在短期復(fù)一次，觀察細(xì)胞對(duì)凍存的適應(yīng)性。已建系的細(xì)胞最好也每年取一支復(fù)一次后，再繼續(xù)凍存。四、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中 的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作如下：1、準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按上述二的傳代法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以使用。2、細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備法：用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)單細(xì)胞 懸液。3、細(xì)胞計(jì)數(shù)：2.1、 蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將

10、特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。2.2、 制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液（如5 滴）到一離心管中，加入等體積臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，不考慮細(xì)胞的活力，則可省略臺(tái)盼藍(lán)染色步驟。2.3、 、將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。2.4、 統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)格后，數(shù)出四角的四個(gè)大格（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒(méi)有

11、被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。2.5、 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml=（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4） X2X104說(shuō)明：公式中除以4 因?yàn)橛?jì)數(shù)了4 個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2 因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1 ： 1 稀釋。公式中乘以104 因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm （長(zhǎng)）x 1.0mm （寬）X0.1mm （高）=0.1mm3 ；而 1ml = 1000mm3細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻

12、細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊梢中，否則要重新計(jì)數(shù)。注：4臺(tái)盼藍(lán)母液的配制：稱取 4 克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100 毫升，用濾紙過(guò)濾，4 c保存。使用時(shí)，用PBS稀釋至0.4%。五、細(xì)胞活力的測(cè)定1.染料排斥試驗(yàn)：其原理是細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些染料可穿透細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞則能阻止該染料進(jìn)入細(xì)胞。借此可鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。常用的染料

13、有臺(tái)盼藍(lán)、伊紅 Y和苯胺黑等。以臺(tái)盼藍(lán)染色為例。步驟同上述細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作步驟。注意以下幾點(diǎn):計(jì)數(shù)：在310min,用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞（死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞則拒染）。臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)，時(shí)間不宜太長(zhǎng)，否則活細(xì)胞也會(huì)著色，從而干擾計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞率（）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)十死細(xì)胞總數(shù)）X100%2、MTT比色實(shí)驗(yàn)：可測(cè)定測(cè)藥物或病毒的IC50原理：活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮噪鹽（MTT）,還原成紫色不溶性結(jié)晶物，沉積于細(xì)胞中。用酸性異丙醇或DMSO 溶解后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值。紫色不溶性結(jié)晶物形成的多少與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)相關(guān)。2.1、 將細(xì)胞接種于96板上，密

14、度為大約105個(gè)/ml,每接種100此2.2、 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入待測(cè)樣品；2.3、 作用一定的時(shí)間之后，加入三蒸水配制的 5閔/ml的MTT溶液，每20此2.4、 37溫育 4小時(shí)；2.5、 取出培養(yǎng)板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的藍(lán)紫色沉淀；如果是懸浮細(xì)胞則用板離心機(jī)離心后除去上清；2.6、 每加入100出的DMSO,搖床上搖動(dòng)30分鐘以使沉淀溶解；2.7、 用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（DNA Expert）在595nm （或490nm）波長(zhǎng)處檢測(cè)96 平板中每細(xì)胞的光密度值（ OD 值），按下列公式計(jì)算藥物或病毒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：細(xì)胞存活率（）=治療組 OD值/對(duì)照組OD值X100%2.8

15、、 求出各藥物（或病毒）濃度下的OD 值占對(duì)照OD 值的百分比，用此百分比對(duì)藥物（或病毒）濃度作圖；在所得的曲線上，百分比值為50時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度就是IC50值。或根據(jù)各濃度下細(xì)胞的存活率，采用Logit法計(jì)算IC50。六、細(xì)胞的運(yùn)輸裝運(yùn)細(xì)胞的法有兩種：1、冷凍貯存運(yùn)輸即利用特殊盛液氮或干冰凍存，保存效果較好，但較麻煩，且不能長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，多需空運(yùn)。2、充液法2.1、 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，充滿新培養(yǎng)液，液量要達(dá)到培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞以膠塞，保留微量空氣。若空氣留量過(guò)多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來(lái)回流動(dòng)對(duì)細(xì)胞有干擾作用。2.2、 妥善包裝、運(yùn)輸。一般在四五天到達(dá)目的地，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)多大影響，時(shí)

16、間過(guò)長(zhǎng)則細(xì)胞活力下降。2.3、 到達(dá)目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的液量，置37培養(yǎng), 次日傳代。注：從其他研究室所取細(xì)胞時(shí)，應(yīng)注意了解細(xì)胞的性狀、培養(yǎng)液、培養(yǎng)時(shí)的注 意事項(xiàng)等【 細(xì)胞轉(zhuǎn)染】一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Lipofetmiane 2000 ）1、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的處理（以24 板培養(yǎng)為例）：貼壁細(xì)胞：在轉(zhuǎn)染前一天，在 24板鋪上0.5X105細(xì)胞，500ul無(wú)抗生素培養(yǎng)基 培養(yǎng)一天，到轉(zhuǎn)染時(shí)使細(xì)胞達(dá)到 80%90%的匯合率。懸浮細(xì)胞在制備混合物前，將48X105細(xì)胞用無(wú)抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)鋪鋪于 24 板。2、轉(zhuǎn)染法（以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染為例）2.1、 將 DNA 質(zhì)粒溶于 50ul 無(wú)

17、血清的 OptiMEM I Reduced Serum Medium 中。混合均勻。2.2、 將適量Lipofectamine 2000溶于50ul無(wú)血清的Opti MEM I中，混合均勻。在室溫下孵育5 分鐘（在25 分鐘進(jìn)行步驟c）。2.3、 孵育5分鐘后，將上述兩種混合物混合（總體積100ul）。輕輕混合均勻在室溫下孵育25 分鐘（可能出現(xiàn)霧狀沉淀）。復(fù)合無(wú)在室溫下六小時(shí)穩(wěn)定。2.4、 在24板中每加入100ul 的復(fù)合物以及適量培養(yǎng)基。十字法混合均勻。2.5、 細(xì)胞在37。C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 48個(gè)小時(shí)后，測(cè)量轉(zhuǎn)染效率。在加完復(fù)合物4 6 小時(shí)候可更換培養(yǎng)基。3、轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)3

18、.1、 轉(zhuǎn)染格來(lái)說(shuō)，每種細(xì)胞的條件是不一樣的，如果實(shí)驗(yàn)時(shí)，不能確定最佳轉(zhuǎn)染條件，請(qǐng)?jiān)诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)組共享文件夾查找類似細(xì)胞的轉(zhuǎn)染法；3.2、 轉(zhuǎn)染結(jié)果的好壞，與DNA 質(zhì)量密切相關(guān)，務(wù)必在實(shí)驗(yàn)之前對(duì)去毒素質(zhì)粒DNA 的質(zhì)量進(jìn)行格鑒定，至少采用以下兩種法：瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測(cè)，如果有條件，可對(duì)質(zhì)粒DNA 去毒素質(zhì)量的進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作法【小量細(xì)胞樣品TotalRNA的提取法】一、實(shí)驗(yàn)步驟（以細(xì)胞為例）1.1、 細(xì)胞樣品（1.0X107個(gè)）去上清之后，加入1ml TRIzol溶液反復(fù)吹打至溶 液清亮，轉(zhuǎn)移入1.5ml Tube中室溫下放置10min ,如不能立即提取則放于-80 C

19、保存（可保存一個(gè)月），提取時(shí)取出放于室溫融化；也可按照正常凍存法保存1X107個(gè)細(xì)胞，提取時(shí)37c迅速融化，5000rpm離心3min去除上清液后迅速加 入 1ml TRIzol 溶液反復(fù)吹打至溶液清亮，室溫下放置10min；1.2、 加入200ul 氯仿（ 1/5TRIzol 體積），先用槍混勻10-15 下，再充分顛倒混勻2min ,使兩相充分混合，室溫靜置 3min ;1.3、 4C、10000g （12000rpm）離心 15min;1.4、 小心吸取上清（中間有厚厚的蛋白層）至一新的1.5ml Tube 中（可取干凈），加入0.5ml 異丙醇（1/2 TRIzol 體積）先用槍混勻1

20、0-15 下，再充分顛倒混勻2min ,室溫放置10min;1.5、 4C、10000g （12000rpm）離心 10min;1.6、 小心吸去上清液（注意不要吸起白色沉淀），加入1ml 70%乙醇（-20 預(yù)冷）旋轉(zhuǎn)漂洗RNA沉淀；1.7、 4 C、10000g （12000rpm）離心 5min;1.8、 小心吸去上清液，空氣中干燥 2-3min ,加入84ul DEPC水充分溶解RNA （如溶解困難，4c放置過(guò)夜）；將RNA稀釋5倍，電泳，（若是對(duì)RNA的質(zhì)量要求不高，做到這一步即可，以下是純化的步驟）依次力口入 2ul RNase Inhibitor <40U/ul >

21、, 10ul 10 xDNase I Buffer, 4ul DNase I RNase Free5U/ul ，充分混勻后37反應(yīng)60min；1.9、 補(bǔ)力口 200ul DEPC水至總體積300ul,再力口入300ul PCI （DEPC水飽和）， 充分混勻 5min,室溫 10000g （12000rpm）離心 10min;1.10、 小心取上清（幾乎看不見(jiàn)中間層，取的較干凈）于一新的1.5ml Tube 中，再加入 300ul CI,充分混勻 5min,室溫 10000g （12000rpm）離心 10min;1.11、 小心取出上清液（幾乎看不見(jiàn)中間層，取的較干凈）于一新的1.5ml

22、Tube中，加入30ul 3M CH3COONa 充分混勻1min 后加入 750ul 無(wú)水乙醇（-20 預(yù)冷），充分混勻2min ， -20 放置 40min；1.12、 4C、10000g （12000rpm）離心15min,小心取出上清（可用槍取干凈）；1.13、 加入1ml 70%ZJI （ DEPC水配制）（-20 C預(yù)冷），旋轉(zhuǎn)振蕩清洗 RNA 沉淀，4C、10000g （12000rpm）離心 10min ;1.14、 小心吸去上清液，室溫干燥 2-3min ,加入80ul DEPC水溶解；1.15、 分別取2ul RNA溶液溶于10ul DEPC水中，混勻后各取出5ul進(jìn)行1%

23、 脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判定 RNA是否有降解；1.16、 按照電泳結(jié)果估計(jì) RNA濃度，按比例使用TE Buffer （PH 8.0）稀釋到0.3至 0.5OD 吸光度圍；二、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.1、 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該使用橡膠手套和口罩，實(shí)驗(yàn)前，使用70%乙醇擦拭雙手和工作臺(tái)以及實(shí)驗(yàn)用品；1.2、 實(shí)驗(yàn)用試劑必須保證質(zhì)量，對(duì)pH 值有要求的必須以滅菌后的測(cè)量值為準(zhǔn)；1.3、 貴重的樣品，抽完之后，必須取出一定量作為實(shí)驗(yàn)室保存；1.4、 必要時(shí)，可以將槍頭剪掉一部分使用，以免 RNA大量斷裂?！綪BS溶液的配制使用以及保存法】一、試劑用途實(shí)驗(yàn)中主要用來(lái)溶解稀釋固體試劑，形成含有緩沖體系的鹽離

24、子溶液二、配制，使用和保存法1、溶液配制按1L的標(biāo)準(zhǔn)量配制稱取下列藥品：NaCl 8.0gNa2HPO4 1.15gKCl 0.2gKH2PO4 0.2g溶解、定容，使用實(shí)驗(yàn)室用超純水；2、除菌實(shí)驗(yàn)室采用過(guò)濾滅菌，使用0.22即的除菌膜；4保存。3、使用使用過(guò)程中應(yīng)該保證格的無(wú)菌操作，為了防止污染，可用50ml 無(wú)菌離心管對(duì)dPBS進(jìn)行分裝?！究股嘏渲剖褂靡约氨４娣ā恳?、原核細(xì)胞用抗生素細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，為了防止培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)菌污染，需要在培養(yǎng)基中添 加雙抗，即青霉素和鏈霉素。1、藥物使用濃度根據(jù)細(xì)胞種類的不同，一般（P/S）的終濃度保持在100U/ml,具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程 中，可以根據(jù)細(xì)胞

25、對(duì)抗生素的敏感程度減少或增加雙抗用量，原則來(lái)說(shuō)，抗生素的使用圍為：50U/ml-200 U/ml 。2、藥物配制法（干粉狀的抗生素）2.1、 藥物溶解使用少量的dPBS溶液溶解干粉狀的抗生素，溶解過(guò)程中，應(yīng)盡量減少 dPBS的用量，使藥物保持在較高濃度；2.2、 溶液除菌使用0.22 g的除菌膜過(guò)濾，然后分裝，-20 C保存。2.3、 日常使用按實(shí)驗(yàn)要求的終濃度將抗生素溶液添加到培養(yǎng)基當(dāng)中，注意無(wú)菌操作。2.4、 注意事項(xiàng)總的原則是現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量減少溶液反復(fù)凍融次數(shù)，防止抗生素失效；培養(yǎng)基最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，在含有血清的完全培養(yǎng)基中，添加抗生素，應(yīng)4c保存且有效使用期不能超過(guò)1 個(gè)月。抗生素并非越

26、多越好，在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞條件不明確之前，應(yīng)該先從最小使用量開 始。二、真核細(xì)胞用抗生素本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在常用的真核用篩選標(biāo)記物主要有兩種：neomycin( G418) 和Puromycin ,實(shí)驗(yàn)中主要用來(lái)篩選細(xì)胞穩(wěn)定株或者陽(yáng)性細(xì)胞群落。1、藥物配制和保存法如下：藥品 保存 溶液配制G418 Prepared in a highly buffered solution (e.g. 100 mM HEPES, pH 7.3, or cell culture medium).本實(shí)驗(yàn)室使用dPBS， pH 7.3固體保存：SHELF (+20° C). This product is stable

27、for 2 years液體保存： Following reconstitution, sterilize by filtration through a 0.22 即 or 0.45 gm pore size filter, aliquot and freeze (-20 C) for long term storage or refrigerate (+4 °C) for short-term storage. assupplied. Sterile stock solutions are stable for at least 1 year at +4 ° C.Hygr

28、omycin B Sterile-filtered at 50 mg/ml active antibiotic in PBS; Sterile- filtered at 50 mg/ml active antibiotic in 50mM HEPES, PH7.2. 本實(shí)驗(yàn)室使用 dPBS， pH 7.3 固體保存：Storage at 4， is stable for 2-3years assupplied.Puromycin Soluble in H2O ( 50 mg/ml ) or methanol (20 mg/ml)本實(shí)驗(yàn)室使用dPBS， pH 7.3固體保存：Freezer(-20 ).Protect from moisture. Followingreconstitution,sterilize by filtration through a 0.22 um pore-size filter,aliquot and freeze (-20 ).This product is atable