酵母RNA的提取

1、酵母 RNA 的提取實驗目的：1了解從植物、動物等材料中提取有效成分的方法途徑，掌握在實驗過程中細胞破壁的方法。2. 了解酵母RNA提取的不同方法，掌握稀堿法提取 RNA的技術。二 實驗原理：稀堿法使用稀堿（%氫氧化鈉）使酵母細胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質和菌體后的上清夜用乙醇沉淀 RNA或調利用等電點沉淀。三 實驗技術：1細胞破壁的方法：（ 1）物理方法：研磨法，組織搗碎器法（低溫操作，防止變性），超聲波法，壓砸法，凍融法。（ 2）溶脹和自溶：溶脹 細胞壁內外存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，引起細胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。自溶 細胞結構在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱

2、自溶。（ 3）化學方法：用脂溶性的溶劑或表面活性劑處理細胞時，可把細胞壁、細胞膜的結構部分溶解，進而使細胞釋放出各種有效成分，導致整個細胞破碎。（ 4）生物酶降解法：如溶菌酶有降解細胞壁的功能。2生物材料的選擇：原材料豐富，易得、廉價、有效成分含量高。3溶劑的選擇：有效成分溶解度盡可能的大，不發(fā)生化學反應，不改變有效成分的化學性質，價格低，成本低，收益高。4影響提取的因素：溶液PH 值，溶劑的極性和離子強度，溫度，水解酶，攪拌， 金屬離子，抽提液與抽提物的比例要適當，一般5： 15.酵母RNA的提取方法：苯酚法一保存了生物活性，去污劑法，濃鹽法，稀堿法。四 試劑：1. %氫氧化鈉2. 95%酸

3、性乙醇：500 毫升乙醇加5毫升濃鹽酸。3. 95%乙醇4. 無水乙醇五 儀器：離心機、電爐、米浴鍋、天平等六 操作：稱取 4 克干酵母粉置于200 毫升錐形瓶中，加入40 毫升%氫氧化鈉溶液，沸水浴30 分鐘，經常攪拌，后流水冷卻，4000 轉 /分離心15 分鐘，取上清液，加入 40 毫升95%酸性乙醇，邊加邊攪拌，后靜置5 分鐘，再4000 轉 /分離心5分鐘，保留沉淀，再用95%乙醇20 毫升洗滌兩次，每次洗后3000 轉 /分離心5分鐘，再用20 毫升無水乙醇分兩次洗滌，每次洗后3000 轉 /分離心 5 分鐘，收集沉淀于濾紙上干燥備用。產量計算：RNA量干酵母粉RNA含量=X 10

4、0%干酵母粉量七 注意事項：1沸水浴要加小漏斗回流，經常攪拌。2離心機的使用，要注意平衡、轉速調節(jié)由慢至快，對稱放置等。3電爐安全使用。4天平使用，稱量要注意的問題。紫外吸收法測量 RNA含量一 試驗目的：1了解測量核酸濃度不同方法的原理。2掌握紫外吸收法測核酸濃度的原理和技術。二 試驗原理：1紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外線的性質，在波長260nm 處有最大吸收，且在一定濃度范圍內光吸收值與濃度成正比（0-50 微克 /毫升） ，符合朗伯-比爾定律。優(yōu)點是樣品用量少，不用顯色，測完后樣品可以繼續(xù)使用。2地衣酚顯色法：核酸與濃鹽酸共熱，發(fā)生降解，生成糠醛，后者與地衣酚反應，在三價鐵離子或二價

5、銅離子作用下，生成鮮綠色的復合物，670nm 處有最大吸收，且光吸收值與濃度成正比，符合朗伯-比爾定律。缺點是反應特異性差，易受干擾。3定磷法：在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中無機磷酸生成磷鉬酸，當有還原劑存在時，磷鉬酸立即被還原生成藍色的還原產物-鉬藍，其最大吸收在 660nm 處，當無機磷含量在每毫升1-25微克范圍內，光吸收與含磷量成正比。 測量樣品核酸的總磷量，需先將它用硫酸或高氯酸消化成無機磷再行測定?？偭琢繙p去未消化樣品中測得的無機磷量，即得核酸含磷量，由此可計算出核酸含量。優(yōu)點是測量準確，缺點是操作繁瑣。三 化學試劑1 .酵母粉 2. %氫氧化鈉溶液3. pH1-14試紙4.標準核酸：100微克/毫升四實驗儀器1紫外分光光度計2. 精密電子天平五實驗操作1 .準確稱取克樣品核酸，加2毫升氫氧化鈉溶液和1毫升水溶解，調成糊狀， 再加入50毫升左右水溶解，邊溶解邊轉移到 100毫升燒杯中，用氫氧化鈉調 至中性，定容至100毫升，再取2毫升定容至100毫升備用。（開始溶液呈乳白 色，完全溶解后變?yōu)槌吻逋该魅芤海? .制作標準曲線，測定樣品：管號標準曲線樣品（稀釋2次）100倍編號123456789標準RNA9水4311260nmOD濃度ug/ml5102030404524容量瓶中的濃度是2400u