酵母蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定

1、醉母蔗糖的米氏常數(shù)的測(cè)定原理當(dāng)環(huán)境的溫度、pH和酶濃度等條件恒定時(shí)，酶促反應(yīng)的初速度 V隨底物的濃度S增高 而加快，直至達(dá)到一極限，即最大反應(yīng)速度Vma為根據(jù)底物濃度和反應(yīng)速度的這種關(guān)系，Michaelis-Menten 推導(dǎo)得出如下公式：_ VmaxSV = Km +S式中Km為米氏常數(shù)。它是酶的特征性常數(shù)。測(cè)定Km是研究酶的一項(xiàng)重要工作。大多數(shù)酶Km 10310-5mol/L左右。但是 Michaelis-Menten 方程中反應(yīng)速度 V與底物濃度S 之間為雙曲線關(guān)系，通過作圖求Km值極不方便。Lineweaver-Burk 根據(jù)米氏方程又推導(dǎo)出如下直線方程：1Kmi1=+V Vmax S

2、 Vmax以1/S為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，將各點(diǎn)連成一直線，此線向左延長(zhǎng)與橫軸相交處即 為米氏常數(shù)（Km的負(fù)值。本實(shí)驗(yàn)是用比色法測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)、 一定量的蔗糖酶作用于不同濃度的底物（蔗糖）生1Km成產(chǎn)物的量，即葡萄糖的量。此產(chǎn)物的生成量為反應(yīng)速度，然后按Lineweaver-Burk雙倒數(shù) 作圖法作圖（圖14）,就可以求出 Km值。S圖14 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法試劑1. 0.03mol/L蔗糖溶液。2. 0.2mol/L pH5.0 醋酸緩沖液：取 0.2mol/L 醋酸鈉溶液 70ml與0.2mol/L 乙酸溶液 30ml相混合。3.蔗糖酶溶液：干酵母 2.5g置研

3、缽中，加蒸儲(chǔ)水 4ml,用力研磨10分鐘，轉(zhuǎn)移到離心管 中，用25ml蒸儲(chǔ)水洗研缽，并將洗滌液一起轉(zhuǎn)移到離心管中，搖勻，靜置 50分鐘，離心 (2000r/min 5min )，小心取出上清夜備用。置冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要用蒸儲(chǔ)水適當(dāng)稀釋。(約25倍稀釋)4 .堿性硫酸銅溶液：取無水Na2CO40g溶于400ml蒸儲(chǔ)水中；酒石酸 7.5g溶于350ml蒸儲(chǔ)水中；結(jié)晶硫酸銅(CuSO 5HO) 4.5g溶于200ml蒸儲(chǔ)水中，以上分別加熱促溶。冷 卻后將酒石酸溶液傾入Na2CO溶液中，混勻。再將硫酸銅溶液傾入，并加蒸儲(chǔ)水至總量為1000mlo此試劑可在室溫中長(zhǎng)期保存。如放置數(shù)周后生成沉淀，可用

4、優(yōu)質(zhì)濾紙過濾后使用。5 .磷鋁酸試劑：燒杯內(nèi)加入鋁酸 70g,鴇酸鈉10g,10%NaOH400ml及蒸儲(chǔ)水400ml。 煮沸2040分鐘以除去鋁酸內(nèi)可能存在的氨。 冷卻移入1000ml容量瓶?jī)?nèi)，加濃磷酸(85%) 250ml,混勻。最后以蒸儲(chǔ)水稀釋至 1000ml o6 .葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05mg/ml )：(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液：(10 mg/ml)：以分析天平稱取1.000g純葡萄糖，置于小燒 杯中加0.25%苯甲酸溶液使溶解，傾入100ml容量瓶中以0.25%苯甲酸溶液稀釋至刻度。(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.05mg/ml )：用吸管吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液5.0ml放入1000

5、ml容量瓶?jī)?nèi)，用0.25%苯甲酸溶液稀釋致刻度。主要器材1 .恒溫水浴及沸水浴2 . 721分光光度計(jì)主要操作步驟1 .將蔗糖酶溶液置 30 c水浴預(yù)溫5分鐘。2 .取試管5支，編號(hào)，按表14操作。表14試劑(ml)123450.03mol/L蔗糖溶液5.02.51.51.00蒸儲(chǔ)水02.53.54.05.0pH5.0醋酸緩沖液0.50.50.50.50.5充分混勻，30 C水浴預(yù)溫5分鐘蔗糖酶溶液0.50.50.50.50.5立即混勻，30 C水浴準(zhǔn)確保溫10分鐘堿性硫酸銅溶液1.01.01.01.01.0混勻，中止酶反應(yīng)。另取試管6支，編號(hào)。向15管加入上面相對(duì)應(yīng)的 5管反應(yīng)液各0.5ml

6、,再各加蒸儲(chǔ)水1.5ml;第6管加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 2ml。然后按表15操作：表15管號(hào)試齊J (ml)123456堿性硫酸銅溶液2.0 2.02.02.0 2.0 2.0混勻，置沸水浴8分鐘，取出冷卻磷鋁酸試劑2.0 2.02.02.02.0 2.0混勻，靜置3蒸儲(chǔ)水2.0 2.02.0 2.02.0 2.0將各管混勻，選用420nm波長(zhǎng)比色，以第5管作為空白管調(diào)零，第 6管作為標(biāo)準(zhǔn)管，記 錄各管光密度。結(jié)果與計(jì)算酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的還原糖的mol數(shù)按下式計(jì)算:測(cè)定管光密度7 n1000還原糖（mol） =X 0 1 X 二0-X000標(biāo)準(zhǔn)管光密度0 5180按照Lineweaver-Burk 作圖法，以1/S為橫坐標(biāo)，10分鐘內(nèi)