無(wú)縫克隆,同源重組克隆

1、1.1.1 Gibson assembly簡(jiǎn)介(INTRODUCTION)原理：Gibson assembly是一種one step, one pot 的快速基因組裝 方法。它只需要將基因片段和需要的三種酶混合在同一個(gè)管內(nèi)在50 C下培養(yǎng)15-60 min就可以得到組裝好的 DNA裝配原理基于DNAt段間的重疊區(qū)域，過(guò)程依賴于三種酶：DNA外切 酶(T5 exonuclease),高保真 DN膘合酶。(Phusion polymerase) 和耐熱DN旌接酶(Taq DNAigase )的共同作用。首先，T5核酸 外切酶消化DNA片段的鏈 方向是從5到3.每個(gè)DNAt段分別 形成一個(gè)單鏈的突出

2、部分，由于著這兩個(gè)相鄰的突出片段有一部分具 有同源性能夠互補(bǔ)，所以 DNAt段退火，互補(bǔ)的序列重新配對(duì)連接。然后，在空缺的部分DN膘合酶以另一條DN嬋鏈為模板，沿3方 向?qū)?duì)應(yīng)的脫氧核甘酸連接到單鏈上，填補(bǔ)缺口。最后，連接酶將兩Gaboon Assembly0K rWE如 Ell.Full,寓濟(jì)*面。2d mAAdd k/Jgll% LuGibwn AssemblyMaster Mi宣incubate 聞 50pClo-i 15-60 mrillesOiA ou xulan曲a條DNA單鏈黏合起來(lái)，密封裂縫。這樣具有重疊區(qū)域的DNAt段就組裝成一整條DN砌子了。下面是組裝的示意圖 材料（MAT

3、ERIALS）試劑（REAGENTSNAD H2O ,1 M MgC2, 1 M DTT； 10 mM dNTP mix 1 M Tris-HCl pH , 50% PEG-8000 mg/ mL Tag ligase , g/ mL T5_ExO, Phusion（1 X）、LB培養(yǎng)基、抗生素（據(jù)載體而定）、LB平板（相應(yīng) 抗性）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（SETUP于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系。如果不慎將液體粘在管壁，可通 過(guò)短暫離心使其沉入管底。4x isothermal assembly buffer20NAD mgH2O300 pL1MMgC2300 pL1MDTT300 pL10mMdNTPmix

4、600 pL1 M Tris-HCl pH3mL50% PEG-80003 mL加水到mL,每管分500 pL存于-20 C或-80 C冰箱，夠3000 個(gè)反應(yīng)2x assembly mix: best combination:100reaction1 mLmg/mLTag ligase10 pLwg/ mL T5_ExO100i LPhusion(1 x)25 pL4X.buffer500 口加水365 pL,存于-20 C冰箱，有效期1年。實(shí)驗(yàn)步驟( PROCEDURE1 .設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR勺方法在DNAt段的兩端加上同源片段，NEBH 薦同源片段的長(zhǎng)度為15-40 bp,同時(shí)要求這部分

5、對(duì)應(yīng)的退火溫度 高于4 C2 .進(jìn)行DNA屯化：PCFT物進(jìn)行瓊脂糖電泳，膠回收?；蛘逷CFT物 回收試劑盒回收。3 .進(jìn)行重組反應(yīng)，以20 pL反應(yīng)體系為例：組分加入量Isothermal assembly Master Mix 10 L線性化載體10-100ng (1- 2 pL)8-補(bǔ)足至插入片段（3- 5X載體）Sterilized ddH 2O20 口50 C 反應(yīng) 15-60 min4 .反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板及克隆鑒定同傳統(tǒng)分子克隆方法。針對(duì)性建議1 .在選擇克隆位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)避免選擇克隆位點(diǎn)上下游50 bp內(nèi)有重復(fù)序列的區(qū)域。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游 20 bp區(qū)域內(nèi)GC含量士在40%- 60施圍之內(nèi)時(shí)，重組效率將達(dá)到最大。如這部分區(qū)域GC含量高于70%g者低于30%重組效率會(huì)受到較大影響。2 . Gi