黃芪多糖佐劑對(duì)Ⅰ型鴨疫里氏桿菌滅活疫苗的作用研究.docx

1、黃茂多糖佐劑對(duì)I型鴨疫里氏桿滅活疫苗的作用研究金爾光，陳潔，錢運(yùn)國，陳橙，曾新華，宮時(shí)玉，華娟（武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢430065）摘要：本研究以I型鴨疫里氏桿菌武漢分離株為菌種，經(jīng)復(fù)蘇、增菌、濃縮、滅活后與黃注多糖佐劑混合制成滅活疫苗。試驗(yàn)鴨在5日齡時(shí)按最佳免疫劑量（0.3mL/H）注射疫苗，免疫后第3、7、10、14、21天的攻毒保護(hù)率分別為100%、90%、100%、100%、90%,免疫后第3天即能用瓊脂擴(kuò)散法在血清中檢測(cè)出I型鴨疫里氏桿菌特異性抗體，效價(jià)逐漸升高，至免疫后第10天達(dá)高峰（PV0.01）。試驗(yàn)結(jié)果表明，該滅活疫苗能有效預(yù)防鴨傳染性漿膜炎。關(guān)鍵詞：1型鴨疫里氏桿菌

2、；鴨傳染性漿膜炎；黃芷多糖；滅活疫苗中圖分類號(hào)：S862.4+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A黃芷多糖（astragaluspolysaccharideAPS）是中藥黃茂中主要的天然活性成分，具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能、增加白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量、提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性、誘生干擾素等作用（Qiu等，2007）。本研究將APS作為免疫佐劑，與本地分離的I型鴨疫里氏桿菌（RiemerellaanatipestiferRA）混合制苗，并評(píng)價(jià)其保護(hù)效果,旨在提高傳統(tǒng)滅活苗的免疫效果，有效地防控鴨傳染性漿膜炎，也為新型免疫佐劑的研究提供依據(jù)。1材料與方法1菌種I型RA菌株分離自武漢郊區(qū)某肉鴨場(chǎng)，鑒定后凍干保存。1.2

3、 培養(yǎng)基胰酶大豆瓊脂（trypticsoyagar,TSA）和胰酶大豆肉湯（trypticsoybroth,TSB）分別為Difco.Bact。產(chǎn)品，使用時(shí)加10%小牛血清。1.3佐劑原料黃度多糖提取物,純度為75%。1.4 試驗(yàn)動(dòng)物1日齡櫻桃谷鴨，自由采食。1.5 疫苗制備1種子液制備I型RA菌株用TSA平板復(fù)蘇后接種于TSB中，37笆搖振培養(yǎng)1824h,取培養(yǎng)液接種于TSA、血液瓊脂平板進(jìn)行純度檢查，合格后作為種子液.4°C保存，使用期不超過5d。1.5.2 菌液制備將種子液按培養(yǎng)液體積的5%接種到TSB中，37°C通氣搖振培養(yǎng)24ho純度檢查合格后采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)

4、菌計(jì)數(shù)，同時(shí)按菌液體積的0.4%加入甲醛溶液37°C滅活24h。滅收稿日2008-08-18作者簡介：金爾光（1966），男，湖北人，本科.高級(jí)畜牧師，研究方向：動(dòng)物生物技術(shù)及疾病防控技術(shù)。文章編號(hào)：1671-7236（2009）03-0151-02活后調(diào)整菌液濃度至1X10】°CFU/mL,接種于血液瓊脂和TSA平板，5%CC）2、37°C培養(yǎng)48h,無菌生長者用于制備疫苗。1.5.3 APS佐劑制備及配苗將APS配制成所需濃度溶液，115°C滅菌15min后置4°C保存?zhèn)溆?。將滅活菌液與佐劑按等體積混合，同時(shí)按總體積的0.01%加入硫柳汞，

5、制成棕色混懸液，即為鴨傳染性漿膜炎APS滅活疫苗。1.5.4 疫苗的無菌及安全檢查疫苗分別接種于TSA、TSB、血液瓊脂及厭氧肉肝湯，37°C培養(yǎng)57d,觀察有無細(xì)菌生長。30只5日齡健康未免疫櫻桃谷鴨，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別于頸部皮下注射疫苗0.5、1.0、2.0mL/只，觀察7d。1.6疫苗的免疫效果檢驗(yàn)1攻毒菌量的測(cè)定I型RA強(qiáng)毒株經(jīng)復(fù)蘇、增菌后分別調(diào)整濃度至2X1O12X1O2X1O2X102X106及2X105CFU/mL；取70只15日齡健康未免疫鴨隨機(jī)分為7組，每組10只，分別對(duì)應(yīng)上述6個(gè)攻毒劑量和1個(gè)陰性對(duì)照組（生理鹽水）進(jìn)行攻毒，0.5mL/只，腿部肌肉注射

6、，觀察7d,將導(dǎo)致全組試驗(yàn)鴨死亡的最小攻毒劑量定為攻毒劑量。1.6.2 最佳免疫劑量的篩選50只5日齡健康未免疫鴨，隨機(jī)分為5組，每組10只，對(duì)應(yīng)4個(gè)免疫劑量（0.2、0.3、0.5、1.0mL/只）和1個(gè)陰性對(duì)照組（生理鹽水），頸部皮下注射。免疫后第15天按照1.6.1測(cè)定結(jié)果進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒后觀察10do免疫接種及攻毒保護(hù)試驗(yàn)100只5日齡健康未免疫鴨，隨機(jī)分為2大組即免疫組和陰性對(duì)照組，每組又分為5小組，每組10只，分別對(duì)應(yīng)5個(gè)攻毒時(shí)間點(diǎn)：免疫后第3、7、10、14、21天。疫苗組按1.6. 2篩選的最佳免疫劑量注射疫苗，陰性對(duì)照組注射生理鹽水，然后在相應(yīng)的時(shí)間按照1.6.1測(cè)定結(jié)果進(jìn)

7、行攻毒，腿部肌肉注射，觀察7do免疫后血清抗體效價(jià)檢測(cè)50只健康未免疫鴨5日齡注射疫苗，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別對(duì)應(yīng)5個(gè)采樣時(shí)間（免疫后第3、7、10、14、21天），全部在對(duì)應(yīng)的時(shí)間頸靜脈采血，采用瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，結(jié)果用log2表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5進(jìn)行分析。2結(jié)果1疫苗的無菌及安全檢查制備的疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢查，無任何細(xì)菌生長；5日齡雛鴨頸部皮下接種O.5、lO、2.OmL疫苗，均未見異常反應(yīng)。2.2攻毒菌量測(cè)定由表1可知，導(dǎo)致整組全部死亡的最小攻毒劑量為2X108CFU/mL、0.5mL/只，該劑量即為I型RA強(qiáng)毒的攻毒劑量。表1I型RA強(qiáng)毒攻毒劑測(cè)定結(jié)

8、果（n=10）組別攻毒菌液濃度（CFU/mL）注射劑量（mL）死亡鴨數(shù)（只）死亡率（%）12X1050.566022X1O60.588032X1O70.588042X1080.51010052X1090.51010062X10100.5101007生理鹽水0.5002.3最佳免疫劑量篩選試驗(yàn)鴨按0.2、0.3、0.5、1.0mL/只劑量免疫后，攻毒保護(hù)率分別為80%、100%、100%、100%,陰性對(duì)照組無一存活，表明該疫苗的最佳免疫劑量為0.3mL/只，結(jié)果見表2。表2I型RA黃黃多糖滅活疫苗最佳免疫劑篩選結(jié)果蛆別注射劑量試驗(yàn)鴨數(shù)存活鴨數(shù)保護(hù)率（%）（mL/只）（只）（只）10.21088

9、020.3101010030.5101010041.01010100陰性對(duì)照組（生理鹽水）0.510002.4 免疫接種及攻毒保護(hù)試驗(yàn)由表3可見，試驗(yàn)鴨接種1型RA黃芷多糖滅活疫苗后第3、7、10、14.21天的攻毒保護(hù)率分別為100%、90%、100%、100%、90%,平均保護(hù)率達(dá)96%。陰性對(duì)照組注射生理鹽水后同樣進(jìn)行攻毒，第3、7、10、14天后攻毒死亡率為100%,第21天的死亡率為80%,余下的2只處殺后剖檢，可見明顯的纖維素性肝周炎和心包炎。表31型RA黃黃多精滅活疫苗接種后的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果免疫后天數(shù)（d）平均保護(hù)率（%）37101421疫苗組（存活鴨數(shù)/試驗(yàn)鴨數(shù)）10/109

10、/1010/1010/109/1096陰性對(duì)照組（存活鴨數(shù)/試驗(yàn)鴨數(shù)）0/100/100/100/102/1042.5 血清抗體水平檢測(cè)免疫后第3天即能在試驗(yàn)鴨血清中測(cè)出I型RA的特異性抗體，隨后抗體效價(jià)逐步升高，至免疫后第10天達(dá)到高峰（PV0.01）,結(jié)果見圖1o圖1I型RA中藥多糖滅活疫苗接種后的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果（n=10）注：圖中折線上字母不同者，表示差異極顯著（PV0.01）。3討論與小結(jié)黃芷是一種常用的補(bǔ)氣中藥，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，APS是其中主要免疫活性成分，研究結(jié)果顯示，APS與商品疫苗同時(shí)給雞注射，可顯著提高疫苗的保護(hù)作用（Qiu等,2007；Kong等，2004；李宏全等,

11、2005）；張華等（2005）還發(fā)現(xiàn)APS能迅速刺激試驗(yàn)兔的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，并可較長時(shí)間維持較高水平。本研究將APS作為免疫佐劑進(jìn)行配苗，成功研制出I型鴨疫里氏桿菌黃苗多糖滅活苗，最佳免疫注射劑量為0.3mL/只，5日齡雛鴨接種后第3、7、10、14、21天的攻毒保護(hù)率分別為100%、90%、100%、100%、90%,平均保護(hù)率高達(dá)96%,且安全性高，近7倍劑量免疫未見異常反應(yīng)。該疫苗產(chǎn)生保護(hù)力較早，在免疫后第3天保護(hù)率即高達(dá)100%,血清抗體檢測(cè)的結(jié)果卻顯示此時(shí)抗體效價(jià)相當(dāng)?shù)停@可能與免疫后時(shí)間間隔太短，以至試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)未能產(chǎn)生足夠的特異性抗體有關(guān);APS是一種天然的免疫增強(qiáng)劑，能

12、在疫苗本身產(chǎn)生足夠保護(hù)以前，提升整體的免疫水平，尤其是非特異性免疫水平，使機(jī)體不受強(qiáng)毒進(jìn)攻的影響。該疫苗對(duì)細(xì)胞免疫的作用機(jī)理有待于進(jìn)一步深入研究。本研究采用瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)試驗(yàn)鴨血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)總體抗體水平不高（W1:8）,但攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示平均保護(hù)率達(dá)96%,這可能與檢測(cè)方貉源犬瘟熱病毒的分離鑒定劉雙翼，王進(jìn)軼，王延濤，劉合義，侯喜林(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319)摘要：采集大慶某貉養(yǎng)殖場(chǎng)病貉的病料，處理后接種于非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)進(jìn)行病毒分離。對(duì)分離毒株進(jìn)行了中和試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、理化性質(zhì)的鑒定，并用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)感染細(xì)胞中的病毒核

13、酸。病料接種Vero細(xì)胞72h后產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變(CPE)；病毒分離株可以被犬瘟熱病毒陽性血清中和中和效價(jià)為1:25；分離株對(duì)氯仿、乙隧敏感,對(duì)酸和熱抵抗力弱，可以凝集雞紅細(xì)胞，其凝集作用可被犬瘟熱病毒陽性血清所抑制；RT-PCR檢測(cè)病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，擴(kuò)增出的片段長287bp,與預(yù)期設(shè)計(jì)的長度相同，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)與MS01株的同源性為99%。結(jié)果表明，分離的病毒株為犬瘟熱病毒.命名為CDVDQ株。關(guān)鍵詞：貉3犬瘟熱病毒3分離；鑒定中圖分類號(hào):S858.92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B犬瘟熱(caninedistemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(caninedistempervirus,CD

14、V)引起的感染多種動(dòng)物的一種急性、高度接觸收稿日期：2008-09-08作者簡介：劉雙翼(1983-).男,內(nèi)蒙古人，碩士生，研究方向：分子病毒學(xué)。通信作者：侯喜林.男.教授.碩士研究生導(dǎo)師。Emaihxlyhouyahoo,Tel或其他某些原因有關(guān)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。參考文獻(xiàn)1張華.薛家賓，黃克和，等.不同佐劑對(duì)兔出血癥滅活凍干疫苗免疫效果的影響J.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào).2005,25(3)：138140.2李宏全.段縣平，馬海麗，等.黃芷多糖對(duì)雞新城疫和傳染性腔上囊病疫苗免疫力的影響口.中國獸醫(yī)科技,2001,31(9)：1214.3賀奮義.雞減蛋綜合征油乳劑滅活苗的

15、研制口.中國畜牧曾醫(yī)，文章編號(hào)：1671-7236(2009)04-0153-04性傳染病。已有的研究結(jié)果表明，犬瘟熱病毒可感染犬科的其它動(dòng)物(如狐、狼)及鼬科、浣熊科、貓科(如獅、虎、豹)等。Mee等(1998)還從患PAGRTS疾病的病人組織中檢測(cè)出CDV核酸。近年來試驗(yàn)結(jié)果表明，CDV可感染人宮頸癌細(xì)胞系，因此人亦有可能感染(Laffler等，1997),故對(duì)該病毒進(jìn)行研究具有潛在的公共衛(wèi)生意義。2006年2007年在黑龍江省大慶地區(qū)的貉群AYXXAYAYAYAYAAAAYAYAAY»<><AYAYA2005,32(6)：4547.4 KongX,HuYRui

16、Retal.EffectsofChineseherbalmedicinalingredientsonperipherallymphocyteproliferationandserumantibodytiteraftervaccinationinchicken.InternationalImmunop-harmacology,2004,4(7)：975982.5 QiuYHuYL,CuiBAetal.ImmunopotentiatingeffectsoffourChineseherbalpolysaccharidesadministeredatvaccinationinchickens.Poul

17、tryScience,200786(12)：25302535.StudyontheEffectofAstragalusPolysaccharideAdjuvanttoInactivatedVaccineofRiemerellaAnatipestiferSerotypeIJINEr-guang,CHENJie,QIANYun-guo.CHENCheng,ZENGXin-hua,GONGShi-yu,HUAJuan(WuhanInstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,Wuhan430065.China)Abstract：Aninactivatedastraga

18、luspolysaccharide(APS)adjuvantvaccinewasdevelopedwithRiemerellaanatipestifer(RA)serotype1isolatedfromWuhaninthisresearch.Duckswereinoculatedwithoptimaldosage(0.3mL/duck)attheageof5-day.Theprotectionrateswere100%,90%,100%,100%and90%onthe3rd,7th,10th,14thand21stdayaftervaccination,respectively.Immunodiffusionassayshowedth