長(zhǎng)期施氮對(duì)馬鈴薯田土壤剖面硝態(tài)氮積累及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響.docx

1、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)JOURNALOFGANSUAGRICULTURALUNIVERSITY長(zhǎng)期施氮對(duì)馬鈴薯田土壤剖面硝態(tài)氮積累及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響張健，董星晨，張鶴，鄧德雷，羅超越，張春紅，邱慧珍甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘簫省干旱生境作物學(xué)更點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070）摘要：【目的】揭示長(zhǎng)期連續(xù)施氮對(duì)半干旱地區(qū)馬鈴薯田土壤剖面中硝態(tài)氮積累及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響.防法】通過(guò)大田試驗(yàn)設(shè)置了6個(gè)不同的施氮水平：N。不施氮，對(duì)照）、Nm施氮里75kg/hm'）、Nm°確氮星150kg/hm2）、N2"施氮225kg/hm2>*N300施氧量300kg/hm2）和N

2、3?s施氯鼠375kg/hm2），研究連續(xù)4年施氮對(duì)旱地馬鈴茗田土壤剖面中硝態(tài)氮的積累以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響.黯果】隨若施氮里增加，0100cm土壤剖面內(nèi)NOS_-N含量顯著增加PV0.05），尤其020cm土燃表層各施氮處理的NO4_-N含里分別比對(duì)照N。增加了55.8%，】13.9%,162.8%，365.1%和988.4%.Miseq高通量測(cè)序結(jié)果顯示，連續(xù)施氮顯著改變了020cm表層土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，在門水平上的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群中，隨若施氮里增加，各施氮處理土壤放線菌門和擬桿曲門的細(xì)菌的豐度分別比對(duì)照N0處理增加了6.1%17.4%和16.4%46.8%，酸桿菌門的豐度比對(duì)照降低了7

3、.8%26.4%:在綱水平上的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群中，與對(duì)照N“相比，各施氮處理擬桿菌綱細(xì)菌的豐度增加了33. 8吟173.3%AciTbbacterGp4和Anaerolineae的相對(duì)豐度分別降低16.3%33.8%、8.1%22.7%：在屬水平上的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群中，各施氮地理的Ohtaekwangia和Streptomyces細(xì)菌的豐度分別比對(duì)照增加了33.6%173.1溷3.4%66.4%，而Gaiella和Solirubrobacter細(xì)菌的豐度分別比對(duì)照No降低了6.9%30.8%和4. 5%27.6%.連續(xù)4a過(guò)量施氯也顯著降低了土壤細(xì)菌的群落多樣性.RDA冗余分析及相矣性分析結(jié)果

4、表明，土壤NO3-N含宣與放線菌門、擬桿菌門、擬桿菌綱'Ohtaekwangia'Streptomyces犧霉菌屆）和Lysobacter常桿健屬）的細(xì)菌的豐度顯著正相失，與酸桿菌門、Gaiella'SolirubrobacterCt壤紅桿蕙屬）、Gemmatimonas雋單胞菌屬）的細(xì)茵的豐度顯著負(fù)相關(guān).陸論】連續(xù)4a施氮，隨著施氮量增加顯著地提高了土壤剖面中硝態(tài)氮的含量，與對(duì)照No相比，020cm表層土壤細(xì)菌豐度隨若施氮箜培加顯著培加，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且過(guò)箜施氮降低了土壤細(xì)菌的多樣性.RDA分析及person相尖性分析表明，長(zhǎng)期施氮引起土壤硝態(tài)氮含皇的變化是造

5、成土邃細(xì)笛群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主效土壤環(huán)境因子.關(guān)鍵詞：NO-N含五：細(xì)菌Alpha多樣性：細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)：相關(guān)性分析中圖分類號(hào)：S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：100A43152019）01-0030_12DOI：10.13432/ki.jgsau.2019.01.005Effectoflong-termnitrogenapplicationonbacterialcommunitystructureofpotatosoilinsemi-aridareaZHANGJian»DONGXing-chen，ZHANHe，DENGDe-lei»LUOChao-yue*ZHANGCh

6、un-hong，QIUHui-zhenCollegeofResourcesandEnvironmentalSciences，GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience，GansuAgricultura1University.Lanzhou730070,China）Abstract：Objective】InordertoannounceNO3-Naccumulationinsoilprofileofpotatofieldindrylandandtheeffectofbacterialcommunitystructureundercontinuousnit

7、rogenN）fertilizeapplication第一作者：張健，碩士研究生.E-mail：1148126151通信作者：邱菽珍.教授，博士生導(dǎo)腳.主要從事桓物營(yíng)養(yǎng)與營(yíng)養(yǎng)生態(tài)的教學(xué)與科研工作.E-mail：hzqiu基金項(xiàng)目：國(guó)冢至點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃。73計(jì)劃&015CB150501）：國(guó)冢公益性行業(yè)&業(yè)）科研專項(xiàng)&01103004）.收稿日期：2018-03-28：修回日期：2018-04-21多樣性降低&.閉，使得土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在本研究中，連續(xù)4a施氮，相比于其他地理，僅M”處理shannon指數(shù)顯著低于其他施氮處理，而simpson指數(shù)顯著

8、高于其他處理，同時(shí)最高施氮量處理N睥的土壤樣品OTU與Chaol值最低，說(shuō)明長(zhǎng)期過(guò)星施氮可以降低土壤細(xì)菌多樣性，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致.有研究表明在美國(guó)的長(zhǎng)期N投入試驗(yàn)中觀察到，高N施入增加了豐富類群變形菌門和擬桿菌門）的相對(duì)豐度，降低了貧瘠類群酸桿菌門）的相對(duì)豐度血.在土攘營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加時(shí)，豐富類群能利用有效碳源快速生長(zhǎng)，因此可以在較高氮含星的環(huán)境下較好的生長(zhǎng)繁殖，而貧瘠類群在環(huán)境中生長(zhǎng)速度較低，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力較弱，因此在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較高時(shí)，這些貧瘠類群與豐富類群相比競(jìng)爭(zhēng)力較弱，不能良好的生長(zhǎng)繁殖如），導(dǎo)致其數(shù)量下降.本研究結(jié)果表明，連續(xù)4a施氮，各處理優(yōu)勢(shì)菌門的絕對(duì)星發(fā)生了變化，與N。相

9、比，在020cm土層內(nèi).土壤放線菌門和擬桿菌門的豐度隨著施氮星增加顯著提高，酸桿茵門的豐度顯著降低，土壤變形菌門豐度隨著施氮量增加雖整體呈上升趨勢(shì)，但各處理之間并沒(méi)有顯著性差異.這與前人研究結(jié)果一致，由于長(zhǎng)期施氮導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含星顯著增加，土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加，從而促進(jìn)了豐富類群的生長(zhǎng)，抑制了貧瘠類群的生長(zhǎng).有研究報(bào)道&汨變形菌門中許多細(xì)菌類群參與了土壤氮素循環(huán)，與硝化作用有關(guān)的細(xì)菌大多數(shù)屬于變形菌門中的變形菌綱和l變形菌綱，而許多不同種類的細(xì)菌都具有反硝化功能，如放線菌門，厚壁菌門，擬桿菌屬以及變形菌門中的一些細(xì)菌瑚，在本研究中，施氮明顯促進(jìn)了廣變形菌綱細(xì)菌類群的生長(zhǎng)，且檢測(cè)出來(lái)的兩種優(yōu)

10、勢(shì)屬水平的菌群Lysobacter溶桿菌屬）、SteroJDobacter曾桿菌屬）、均屬于r-變形菌綱,Nilrospira硝化螺菌屬）的豐度隨著施氮量增加而升高，值得注意的是，檢測(cè)出來(lái)的Azotobacter固氮菌屬）雖說(shuō)豐度較低，但是相比施氮處理，不施氮處理中Azotobacter的豐度是施氮處理的1.2A2.15倍.說(shuō)明不施氮處理顯著刺激了土壤Azctobacter的生長(zhǎng).氮素的添加能夠促進(jìn)土壤放線菌門細(xì)菌的生長(zhǎng)如），本研究發(fā)現(xiàn)排名前12的優(yōu)勢(shì)屬中，有6個(gè)優(yōu)勢(shì)屬分別是NocaiDioiDes斐諾卡氏菌屬）、Gaiella、Arthrobacter箔桿菌屬Strep-tomyces遂霉菌

11、屬）、Solirubrobacter吐壤紅桿菌屬）、Blastococcus等屬于放線菌綱，其豐度占整個(gè)優(yōu)勢(shì)屬豐度的41.88%其中NocaOoiDes>Ar-throbacter都能將土壤中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽商，且隨著施氮星增加，其豐度顯著升高.而擬桿菌門的豐度整體來(lái)說(shuō)是隨著施氮星下降的，但檢測(cè)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)綱BacteroiDetesincrete擬桿菌綱）以及Ohtaekwangia的豐度均隨著施氮量升高顯著升高，Ohtaekvangia是新發(fā)現(xiàn)的屬于擬桿菌門噬纖維菌科中的新屬心，其具體的生活習(xí)性鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，推測(cè)擬桿菌門中的BacteroiDetesincrete以及Ohtae

12、kwangia的細(xì)菌與反硝化作用密切相關(guān).Gemmatimonals芽泡單菌門）中細(xì)菌類群具有很強(qiáng)的反硝化功能，GemmatimonaDates芽單胞菌屬）具有脫氮的功能'但本研究結(jié)果中與前人研究結(jié)果相悖隊(duì)2盤的是隨著施氮星增加，Gemmati-monaDales的豐度顯著降低，前人研究結(jié)果表明，水氮一體的環(huán)境條件下GemmatimonaDates的豐度隨著施氮量增加而顯著增加，因此推測(cè)，Gemmatimo-naDates對(duì)土壤水分的敏感程度較高，而在旱地土壤中，由于水分不足導(dǎo)致GemmatimonaDates隨著施氮星升高反而呈降低趨勢(shì).值得注意的是，隨著施氮呈增加而增加的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬

13、還有Lysobacter溶桿菌屬）和Streptomy-ces）鏈霉菌屬，而溶桿菌屬細(xì)菌可以抑制一些土傳真菌病害，如水稻白葉枯病、辣椒疫病，對(duì)立枯絲核菌具有明顯的抑制作用溢：而鏈霉菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生抗真菌活性，抗細(xì)菌活性以及抗病毒的毒素s，在本研究中，可能是由于連作和長(zhǎng)期施氮，導(dǎo)致一些對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)有害的細(xì)菌或真菌大量繁殖，刺激了落桿菌屬和鏈霍菌屬的生長(zhǎng).3.3細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與部分土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析長(zhǎng)期施氮顯著影響了土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)，RDA分析表明，長(zhǎng)期施氮引起的土壤硝態(tài)氮含雖和土壤pH變化是影響土壤細(xì)菌群結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子，這與相關(guān)性分析結(jié)果一致，然而，大多數(shù)細(xì)菌都生活在pH為49的

14、環(huán)境中，且大多都能承受pH在01個(gè)單位之間的變化量而本研究發(fā)現(xiàn)隨著施氮量升高，土壤pH相比于其他處理僅在最高施氮星處理?xiàng)l件下降低了0.3個(gè)單位，因此確定了引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的最主效土壤環(huán)境因子是NO3-N含呈，而并非土壤pH值.隨著施氮呈升高，土壤no3-n含星顯著升高，與NO.廣-N含量顯著負(fù)相關(guān)的菌群有Ac-iDobacteria酸桿菌門）'GemmatimonaDctcs芽單胞菌門）,AciIRbacteriaGP6、AciI3obacteriaGP4»Gemmatimonas芽單胞菌屬）>Solirubrobacter（土壤紅桿菌屬）：這是由于酸桿菌門屬于

15、貧瘠類群的，在較高的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中生存競(jìng)爭(zhēng)力不如像放線菌門，擬桿菌門這種富營(yíng)養(yǎng)類群，所以在較高營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下反而不利于其生長(zhǎng)繁殖.但是與前人研究結(jié)果不一致x25的是GemmatimonaI3etes及Gemmatimonas的豐度與土壤硝態(tài)氮含呈顯著負(fù)相關(guān).與硝態(tài)氮含宣顯著正相關(guān)的細(xì)菌類群有BacteroiDetes擬桿菌門）、BacteroiDetesincertaesdl>s（擬桿菌綱）、Arthobacter節(jié)桿菌屬Nocaii>oil>s僂諾卡氏屬）、Ohtaekwangia'Streptomyces魅零菌屬），Ly-sobacter箔桿菌屬），其中BacteroiD

16、etes、Bacte-roiDetesineertaesd>s、Arthobacter、NocarDioiDBs被證實(shí)均與反硝化作用有矣，可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此長(zhǎng)期施氮導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含量升高，進(jìn)而影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，而Streptomy-ces,Lysobacter也隨著施氮雖的升高而升高，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期施氮和連作引起的.4結(jié)論連續(xù)4a施氮顯著提高了土壤剖面中硝態(tài)氮的含雖，隨著施氮量升高，土壤剖面中硝態(tài)氮含量顯著增加,尤其在020cm土壤中各施氮處理各處理土壤NO3_-N含雖分別為4.3,6.7,9.2,11.320.0,46.8mg/kg.分別比對(duì)照增加了55.8%

17、113.9%162.8%365.1蜓988.4%連續(xù)施氮顯著改變了表層土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),降低了土壤細(xì)菌的群落多樣性.連續(xù)四年施氮，隨著施氮雖的增加各陞理的門的絕對(duì)雖發(fā)生了變化，隨著施氮量增加，各施氮地理土壤放線菌門和擬桿菌門的細(xì)菌的豐度分別比對(duì)照N地理增加了1%-17.4%和16.4%46.8%酸桿菌門的豐度比對(duì)照降低了7.8%26.4%在綱水平上的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群中，與對(duì)照No相比，隨著施氮量增加，各處理擬桿菌綱細(xì)菌的豐度分別增加了33.8%44.8%83.3%109.2%173.3%而AcilJobacte-rGp4和Anaerolineae隨著施氮呈增加顯著降低PV0.05）,較No相

18、比，隨著施氮量增加，各處理AciD:）bactcrGp4和Anaerolineae相對(duì)豐度分別降低16.3%33.8%8.1%22.7%：在屬水平上的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群中，各施氮處理的Ohtaekwangia和Streptomyces細(xì)菌的豐度分別比對(duì)照增加了33.6%-173.1%和3.4%66.4%而Gaiella和Solirubrobacter細(xì)菌的豐度分別比對(duì)照No降低了6.9%30.8涵4.5%27.6%連續(xù)過(guò)量施氮也顯著降低了土壤細(xì)菌的群落多樣性.RDA及相矣性分析表明土壤硝態(tài)氮含量的變化是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要土壤環(huán)境因子.參考文獻(xiàn)fi盧建武，邱慧珍，張文明，等.半干旱雨養(yǎng)

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30、lizer，225kg/hm')»N3o0'N-fertilizer*300kg/hm?)»N375,Sl-fertilizer>375kg/hm?)，inordertostudyN03_-Nac-cumulationinsoilprofileofpotatofieldindrylandandtheeffectofbacterialcommunitystructurebyN)fertilizeapplicationforfourconsecutiveyears.(Result1Withtheamountofnitrogenapplied*thenitr

31、ateNO3-N)contentinsoilprofileof0100cmwassignificantlyincreased.Inparticular,thecontentofNO3-Nincreasedby55.8%，113.9%，162.8%，365.1%and988.4%insurfacelayerof020cmcom-paredwithNOtreatment.Miseqhighthroughputsequencingresultsshowedthatthestructureofbacterialcommunityinthesurfacesoilof020cmchangedunderth

32、econditionofcontinuousnitrogenapplication.Withtheamountofnitrogenapplied»theabundanceofsoilActinomycetesandBacteroiDesincreasedby6.1%17.4%and16.4%46.8%comparedwithNotreatment.TheabundanceofAcilDubacterphylumwas7.8%26.4%lowerthanthatofcontrol.Inthedominantclassofbacteria»withtheincreaseofni

33、tro-genapplication，theabundanceofBacteroiDetesincretincreasedby33.8%173.3%，andtherelativeabun-danceofAclJobacterGp4andAnaerolineaedecreasedby16.3%33.8%and8.1%22.7%.Insoilbac-teriaatdominantgenuslevebtheabundanceofOhtaekwangiaandStreptomycesbacteriaincreased33.6%73.1%and3.4%66.4%，respectively，andthea

34、bundanceofGaiellaandSolirubrobacterbacteriadecreased6.9%30.8%and4.5%27.6%respectively»comparedwiththecontrolN(l.Thecommunitydi-versityofsoilbacteriawasalsosignificantlyreducedbyexcessiveapplicationofnitrogenfor4years.RDAredundancyanalysisandpersoncorrelationanalysisshowedthatthecontentofNO3_-Ni

35、nsoilwasposi-tivelycorrelatedwiththeabundanceofbacteriaofActinomyces，BacteroiDetes，BacteroiDetesincertaesd)s，OhtaekwangiaStreptomycesandLysobacter.Therewasasignificantnegativecorrelationbetweenthea-bundanceofGaiella-SolirubrobacterandGemmatimonas.fconclusionlTheNO3-Ncontentinsoilprofileissignificant

36、lyincreasedwiththeincreaseofnitrogenapplicationforfourconsecutiveyears.ComparedwiththecontrolNOtrealment*thebacterialabundanceof020cmsurfacesoilisincreasedsignificantlywiththeincreaseofnitrogenapplicationrale.Thestructureofthebacterialcommunityischanged*andexcessiveapplicationofnitrogenreducedthediv

37、ersityofsoilbacteria.RDAredundancyanalysisandpersoncorrela-tionanalysisshowedthatthechangeofnitratecontentinsoilcausedbynitrogenapplicationforalongtimeisthemainenvironmenta1factorofsoilbacterialcommunitystructurechange.Keywords：NO3-Ncontent：bacterialalphadiversity；bacterialcommunitystructure；correla

38、tionanalysis地處甘肅省中部的定西市是我國(guó)重要的馬鈴茗種蓍和商品薯生產(chǎn)及淀粉加工基地有'中國(guó)馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱是甘肅省最大的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，馬拎著產(chǎn)業(yè)已成為帶動(dòng)農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的戰(zhàn)略性主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)3.然而農(nóng)民為追求高產(chǎn)和高收益，在馬鈴薯種植過(guò)程中肥料投入、尤其是氮肥的投入呈持續(xù)增加，盲目施肥現(xiàn)象十分嚴(yán)重七氮肥的過(guò)量投入，不僅沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的產(chǎn)量，反而降低了馬鈴薯塊莖的品質(zhì)、尤其是窖藏品質(zhì)&45,更為重要的是，長(zhǎng)期大呈施氮在降低氮肥利用率的同時(shí)，導(dǎo)致土壤剖面中硝酸鹽富集，造成嚴(yán)重的資源浪賈以及環(huán)境污染并且顯著影響了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性&-0

39、.±壤細(xì)菌作為主導(dǎo)農(nóng)田土壤微生物的主要類群，可以敏感響應(yīng)土壤養(yǎng)分含量及土壤肥力的變化.本研究設(shè)置長(zhǎng)期定位試驗(yàn)研究，運(yùn)用傳統(tǒng)的土壤農(nóng)化分析方法結(jié)合克隆測(cè)序以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生態(tài)學(xué)研究手段，探討連續(xù)4a施氮對(duì)旱地馬鈴薯田土壤剖面中硝態(tài)氮的積累以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在探明長(zhǎng)期連續(xù)施氮對(duì)土壤剖面硝態(tài)氮含雖的影響以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)不同施氮量的響應(yīng)機(jī)制.1材料與方法1.1試驗(yàn)區(qū)概況田間定位試驗(yàn)始于2013年4月，試驗(yàn)地位于甘肅省定西市安定區(qū)香泉鎮(zhèn)N3字277'，E104°30'34"），海拔20532556m，年均溫度6.9C，年降水呈4

40、00mm左右，多集中在79月.無(wú)霜期140d，80%保證率0°C的積溫為2075.1°C，蒸發(fā)雖1400mm以上，屬中溫帶半干旱氣候.1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同施氮處理：N”對(duì)照：N75施氮雖75kg/hm2N（5o施氮呈150kg/hm?，:N225（施氮量225kg/hn?）：N3oo（施氮星300kg/hm2）；N375施氮量375kg/hm'）.每個(gè)堡理4次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積7.2X9=64.8m。采用寬壟雙行覆膜種植模式，壟寬1.2m，壟間距0.4m，行距0.6m，株距0.2m，種植密度為8.34X10'株/hm>.每個(gè)處理

41、肥底一致，施磷量：R05225kg/hm2,施鉀K20292.5kg/hm2.N肥為尿素N，46%）,P肥為過(guò)磷酸鈣ROs，16%）,鉀肥為硫酸鉀鎂虬0,24%）.供試品種為馬鈴茗青茗九號(hào)'.田間試驗(yàn)于2016年5月1日播種，10月9日收獲.按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法進(jìn)行田間管理.1.3土壤樣品采集在馬鈴著收獲期采集020、2040、4060、6080、80100cm土壤樣品，測(cè)定不同土層土壤硝態(tài)氮含呈.同時(shí)，對(duì)020cm表層土壤采用克隆測(cè)序以及實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定細(xì)菌的群落組成和結(jié)構(gòu).1.4測(cè)定指標(biāo)及方法土壤NO3-N和NH./-N含量的測(cè)定：0.Olmol/LCaCh溶液浸提，震蕩lh，用

42、流動(dòng)分析儀測(cè)定.土壤pH測(cè)定：水土比為5：1，用pH計(jì)測(cè)定.土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定：重銘酸鉀外加熱法.DNA提?。豪肍astDNASpinKitforSoil試劑盒MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA），按照其說(shuō)明書(shū)中的步驟提取土壤總DNA.DNA提取后,分別采用微量紫外分光光度計(jì)WanodropND-1000UV-Vis）測(cè)定土壤DNA的濃度和純度t>?60/D28o和D/D"。）.之后將其稀釋10倍用于PCR模板.PCR：每個(gè)處理的4個(gè)重復(fù)DNA，采用515F/907R對(duì)細(xì)菌16SrDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中，正向引物515F含有12個(gè)堿基的特異Tag標(biāo)簽，

43、用以區(qū)分不同的土壤樣品.PCR擴(kuò)增體系為：25uL的TaKaRaTaqVersion2.0plusdye（TaKaRa，Dalian，China），1pL的10Pmol/L引物，2pLDNA模板，補(bǔ)足21pL的ddH?O至50pL反應(yīng)體系，每次PCR反應(yīng)均設(shè)置無(wú)菌水的陰性對(duì)照.PCR擴(kuò)增條件為：94笆5min，94°C30s，25530s，272°C45s，272'C8min.獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，利用E.Z.N.A©.Cycle-PureKit（OMEGA»Norcross，GA，USA），利用說(shuō)明書(shū)的方法對(duì)其進(jìn)行純化，溶于1OOpLElutionB

44、uffer-利用微量紫外分光光度計(jì)NanodroND1000UVVis）測(cè)定純化后PCR產(chǎn)P-物的濃度.最后將所有樣品等摩爾數(shù)混合，使用VAHTSNanoDNALibraryPrepKitforIlluminaNazyme，Nanjing»China）構(gòu)建高通星測(cè)J序文庫(kù),質(zhì)檢后通過(guò)IlluminaMiseqPE250測(cè)序儀上機(jī)分析.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用Bio-RadCFX96OpticalReal-TimePCRSystem姑io-Rad，Hercules*CA.USA）擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定雖PCR分析.標(biāo)線取自基因代表性克隆重組質(zhì)粒的10倍稀釋樣，稀釋梯度6到8個(gè)，空白樣品的

45、模板為水.然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度計(jì)算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以每克干土中的基因拷貝數(shù)為單位進(jìn)行分析，每個(gè)樣品3次重復(fù).定墾PCR的反應(yīng)體系為20業(yè)，包括1|jLDNA模板、10|jLSYBRPremixExTaqSaKa-Ra，Dalian，China），正向和反向引物分別為0.25yL<10umol/D和8.5業(yè)的滅菌雙蒸水.優(yōu)化后的PCR程序如表1.表1本研究所用的引物和條件Table1Primersandconditionusedinthisstudy引物名稱Primername引物序列任一3')目標(biāo)基因PCR程序PrimersepuenceTargetgenePCRPr

46、ocedure515FGTGCCAGCMGCCGCGG90.95C，3min:39XQ5'C，30s;55P，30s：?：cterial1672,30swithplateread)：Meltcurve65.07RCCGTCAATTCMTTTRAGTTTto95.0'C，increment0.5°C，5s+platereadFF390CGATAACGAACGAGACCTFR1AICCATTCAATCGGTAIT2結(jié)果與分析2.1長(zhǎng)期施氮對(duì)土壤剖面中硝態(tài)氮SL03-SI含量的影響馬鈴薯收獲期土壤剖面各土層中NO廣-N含屋的測(cè)定結(jié)果如表2所示：連續(xù)4a施氮，導(dǎo)致0100cm

47、內(nèi)土壤剖面中NO3-N含量隨著施氮雖增加顯著增加PV0.05),尤其在020cm土壤樣品中，各處理土壤NO3-N含雖分別為4.3、6.7、9.2、IL3、20.0、46.8mg/kg，各施氮地理的NO3_-N含呈分別比對(duì)照No增加了55.8%、113.9%、62.8%.365.1%和988.4%:在各土壤剖面內(nèi)No3-n含量也不相同，隨著土壤剖面深度增加，其Fungal18SrRNAgene95*C，3min:39X05C，30s：55C，30s;72*CIminwithplateread)：Meltcurve65.0to95.0,C»increment0.5*C，5s+plater

48、ead含雖逐漸降低.2.2長(zhǎng)期施氮對(duì)表層土壤理化性質(zhì)的影響表2不同施氮量土壤含量地理Treatment土壤剖面/cmSoilprofile02020404060608080100No4.3±l.51c2.8±0.21d1.4+0.23d1.3±0.431.4+0.39cn756.7±0.97dv3.3±0.2T2.5+0.19d2.9+0.23"2.7+0.18cN|5o9.2±0.8。"4.0土0.263.5±0.70"4.1±0.68"4.9±1.18N2251

49、1.3±1.36°7.1±0.49*7.9+2.or5.3+0.15C6.6+1.16cN3OO20.0±4.52h15.2±1.66b12.7±0.77"11.5±2.21b10.8±1.3511n3T546.8±5.04*32.8+0.8T21.5±5.47"18.4+0.81"M.9土1.43Table2SoilNOj-Ncontentwithdifferentnitrogenratesng*kg-')表3不同施氮處理的部分表層土壤理化性質(zhì)處理Trea

50、tment土邃理化性質(zhì)PhysicalandchemicalpropertiesofsoilpHNO-NNH/+-NOMNn8.29土0.04訃4.3±1.51*0.87±0.04°16.74±0.45N8.36+0.05*6.7±0.97de0.84±0.03“16.02+0.18*N|S08.29±0.02ab9.2±0.80"1.17±0.05°18.15±1.014N22S8.23土0.03b11.3±1.36°1.0410.04"16.

51、63±0.79'N30Q8.23+0.0T20.0±4.52b1.05+0.07"16.60+1.24,N37S8.02±0.04e46.8±5.04°1.05±0.02°17.49±0.94Table3Physicalandchemicalpropertiesofsoilstreatedwithdifferentnitrogenrates連續(xù)5a不同施氮呈，隨著施氮量增加，土壤pH表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，在N伯處理中達(dá)到最大值為8.36,在Na”處理達(dá)到最低&02,與Nu相比降低了0.

52、26,說(shuō)明長(zhǎng)期過(guò)量施氮會(huì)造成土壤pH降低.NH,-N的含雖并未隨著施氮量增加而出現(xiàn)有規(guī)律的變化.通過(guò)對(duì)土壤OM含量的測(cè)定結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，各魁理土壤OM含量均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平,但是N,恥處理的土壤OM含呈為18.15g/kg，明顯要高于其他處理.因此，在合理的施氮范圍內(nèi)，長(zhǎng)期施氮可以增加土壤OM的含量.2.3長(zhǎng)期施氮對(duì)細(xì)菌Alpha多樣性的影響根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，表3中列出了各處理土壤樣品中在相似性0.97條件下得到的Alpha多樣性指數(shù)，其中OTU和Chaol指數(shù)是表征群落豐富度的指數(shù)，OTU越高，代表物種種類越多»Chaol11越大，物種豐度越高:Shannon和simpson指

53、數(shù)是表征微生物多樣性指數(shù).shanon指數(shù)越大，物種多樣堡理Treatment覆蓋度Coverage豐富度Richness多樣性DiversityOTUChaoSimpsonShannonNo0.9513±0.017,2460±434a3521+363'*0.0037+0.0006h6.65+0.13uN750.9575±0.008"2615+136"3589±880.0038土0.0006h6.61土0.04樸N|5(j0.9633+0.004"2669±74"3592±120&quo

54、t;0.0047+0.0008"6.55±0.09“N/250.9511+0.010"2434±136"3398土145"0.0045土0.0007h6.63±0.08"bN.oo0.962()±0.004"2655±236"3588±232"0.0047+0.0004*h6.59±0.05*bNg0.9568+0.009"2437+143"3402土1290.0059±0.0010"6.48+0.llb堡

55、理Treatment覆蓋度Coverage豐富度Richness多樣性DiversityOTUChaoSimpsonShannonNo0.9513±0.017,2460±434a3521+363'*0.0037+0.0006h6.65+0.13uN750.9575±0.008"2615+136"3589±880.0038土0.0006h6.61土0.04樸N|5(j0.9633+0.004"2669±74"3592±120"0.0047+0.0008"6.55

56、7;0.09“N/250.9511+0.010"2434±136"3398土145"0.0045土0.0007h6.63±0.08"bN.oo0.962()±0.004"2655±236"3588±232"0.0047+0.0004*h6.59±0.05*bNg0.9568+0.009"2437+143"3402土1290.0059±0.0010"6.48+0.llb表4不同施艇雖處理的土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table4

57、Alphadiversityindexofsoilbacteriatreatedwithdifferentnitrogenrales呈增加了16.4%-46.8%AciDobacteria中細(xì)菌數(shù)量減少7.8%-26.4%.2.4長(zhǎng)期施氮對(duì)細(xì)菌群落組成的影響2.4.1長(zhǎng)期施氮對(duì)土壤門水平細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群的影響為分析長(zhǎng)期連續(xù)施氮對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，利用meseq高通星測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等微生物學(xué)研究方法對(duì)02。cm表層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.結(jié)果如圖1所示，在門水平上不同施氮處理土壤中排名前9的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群中，Pro-teobacteria變形菌門），AciDobacteria酸桿菌門

58、），Actinobacteria放線菌門）有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，在各堡理中占60%左右.隨著施氮呈的增加各處理的門的絕對(duì)量發(fā)生了變化，在020cm土樣內(nèi)Actinobacte-ria放線菌門）和BacteroiDetes。認(rèn)桿菌門）的豐度顯著提高，SciDobacteria）酸桿菌門的豐度顯著降低，相比于Nn處理，各堡理中Actinobactcria細(xì)菌數(shù)量增加6.1%I100908070.60¥5040302010111111*6. 4%.BacteroiDetes中細(xì)菌數(shù)性越高，simpson指數(shù)越大，物種多樣性越低.隨著施氮雖增加，各地理僅在N375魁理土壤樣品中，shannon指數(shù)顯

59、著低于其他施氮處理，而simpson指數(shù)顯著高于其他處理，雖然各堡理OTU與Cha01指數(shù)雖沒(méi)有顯著性差異，但相比其他處理，N375堡理的土壤樣品OTU與Chaol值最低，這說(shuō)明過(guò)雖施氮可以降低細(xì)菌的多樣性.2.4.2長(zhǎng)期施氮對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)綱細(xì)菌類群的影響為了進(jìn)一步分析長(zhǎng)期施氮對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)不同處理在綱水平上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2所示，在綱水平上不同施氮魁理土壤中前12個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群中，放線菌門中的Acti-nobacter，酸桿菌門中的AciTJobacterGp6以及變形菌綱中的Betaproteobacteria&變形菌綱）、Gam-maproteobacte

60、ria&變形菌綱）和Alphaproteobac-teria&變形菌綱）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在各魁理中占總優(yōu)勢(shì)菌綱的40%左右.隨著施氮量增加，擬桿菌門中的BactcroiEtetesinceratesd>s似桿菌綱）和Acti-nobacter仿攵線菌綱）細(xì)菌的豐度顯著增加（P<0.05），與對(duì)照N。相比，隨著施氮量增加，各處理擬桿菌綱細(xì)菌的豐度分別增加了33.8%、44.8%、83.3%109.2%173.3%而AciDobacterGp4和Anaerolineae隨著施氮量增加顯著降低0V0.05）,較No相比，隨著施氮量增加，各處理Ac-iDobacterGp4和A