種子檢驗(yàn)學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、種子檢驗(yàn)學(xué)實(shí)驗(yàn)種子檢驗(yàn)學(xué)實(shí)驗(yàn)馬守才馬守才 博士博士/ /副教授副教授西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院Email:Email: 種子檢驗(yàn)學(xué)種子檢驗(yàn)學(xué)實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 品種真實(shí)性的品種真實(shí)性的SSRSSR分子標(biāo)記分析分子標(biāo)記分析 一、目的要求一、目的要求 (1) (1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作或現(xiàn)場(chǎng)參觀了解品種真實(shí)性通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作或現(xiàn)場(chǎng)參觀了解品種真實(shí)性SSRSSR分子標(biāo)記分分子標(biāo)記分析的基本儀器設(shè)備、引物和步驟。析的基本儀器設(shè)備、引物和步驟。 (2) (2)學(xué)會(huì)識(shí)別分子標(biāo)記電泳圖譜或照片圖譜，能識(shí)別和判斷學(xué)會(huì)識(shí)別分子標(biāo)記電泳圖譜或照片圖譜，能識(shí)別和判斷品種圖譜的差異。品種圖譜的差異。3二、實(shí)驗(yàn)原理二、

2、實(shí)驗(yàn)原理 簡(jiǎn)單重復(fù)序列簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)(simple sequence repeats,SSR)分布于小麥分布于小麥基因組的不同位置上，不同品種每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位數(shù)目及序列基因組的不同位置上，不同品種每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位數(shù)目及序列可能不同。由于每個(gè)重復(fù)序列兩側(cè)的序列是高度保守和單拷貝的，可能不同。由于每個(gè)重復(fù)序列兩側(cè)的序列是高度保守和單拷貝的，因而可以根據(jù)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用因而可以根據(jù)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用PCRPCR技術(shù)對(duì)重技術(shù)對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到的復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCRPCR產(chǎn)物在電泳過(guò)程中的電場(chǎng)作用下，

3、產(chǎn)物在電泳過(guò)程中的電場(chǎng)作用下，由于分子量大小不同得到分離，經(jīng)硝酸銀染色或者熒光染料標(biāo)記由于分子量大小不同得到分離，經(jīng)硝酸銀染色或者熒光染料標(biāo)記檢測(cè)區(qū)分開(kāi)。檢測(cè)區(qū)分開(kāi)。4 由于不同品種的遺傳組成不同，所以根據(jù)引物由于不同品種的遺傳組成不同，所以根據(jù)引物DNADNA序列序列存在差異或引物結(jié)合部位之間的存在差異或引物結(jié)合部位之間的DNADNA片段大小存在差異，即片段大小存在差異，即可鑒定小麥品種。可鑒定小麥品種。5三、材料和用具三、材料和用具 （見(jiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程）（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程）四、方法和步驟四、方法和步驟( (一一) ) 種子或幼苗種子或幼苗DNADNA提取純化提取純化1.CTAB1.CTAB法法2.SD

4、S2.SDS法法3.3.試劑盒法試劑盒法6（二）（二）PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)組分原濃度 終濃度 反應(yīng)體積（10L）8ddH2O（L）3.0524.410Buffer（不含Mg2+） 10 1 1.08MgCl2(mmol/L) 25 1.25 0.54dNTPs(mmol/L) 10 0.2 0.21.6Tag酶U/L 2 0.05 U 0.252引物(mol/L) 1.25 0.25 2.016DNA(ng/L) 50 15 3.0-PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系7反應(yīng)組分原濃度 終濃度 反應(yīng)體積（15L）10ddH2O（L）4.5MIX 2 0.

5、05 U 7.5引物(mol/L) 1.25 0.25 2.0DNA(ng/L) 50 15 1.0-PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系簡(jiǎn)化簡(jiǎn)化PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系8反應(yīng)程序反應(yīng)程序預(yù)變性：預(yù)變性：9494 5min5min；變變 性性：949430s30s，退退 火火：50-6850-68（依據(jù)引物的退火溫度改變）（依據(jù)引物的退火溫度改變） 45s45s，延延 伸伸：727260s60s，進(jìn)行，進(jìn)行3030次循環(huán)；次循環(huán)；終延伸：終延伸：7272 10min10min。擴(kuò)增產(chǎn)物于擴(kuò)增產(chǎn)物于4 4保存保存9（三）擴(kuò)增產(chǎn)物分離（三）擴(kuò)增產(chǎn)物分離-變性變性PAGEPAGE垂直板電

6、泳垂直板電泳PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系1.1.制膠制膠 玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用雙蒸水、玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用雙蒸水、75%75%乙醇分別擦洗兩遍。乙醇分別擦洗兩遍。 1mL 1mL親和硅烷工作液，均勻涂在長(zhǎng)玻璃板上；將親和硅烷工作液，均勻涂在長(zhǎng)玻璃板上；將1mL1mL剝離硅烷工剝離硅烷工作液，均勻涂在帶凹槽的短玻璃板上。（防止相互污染）作液，均勻涂在帶凹槽的短玻璃板上。（防止相互污染） 玻璃板徹底干燥后，將玻璃板徹底干燥后，將0.4mm 0.4mm 厚的塑料隔條整齊放在長(zhǎng)玻璃板厚的塑料隔條整齊放在長(zhǎng)玻璃板兩側(cè)，蓋上凹槽短玻璃板，夾子固定；兩側(cè)，蓋上凹槽短玻璃板，夾子固定；10PC

7、RPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系 取取80mL80mL 6% 6%聚丙烯酰胺變性凝膠溶液，加入聚丙烯酰胺變性凝膠溶液，加入6060 LTEMEDLTEMED、180180 L 10%L 10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨，輕輕搖勻，將膠灌入玻璃膠室，灌膠過(guò)，輕輕搖勻，將膠灌入玻璃膠室，灌膠過(guò)程應(yīng)防止氣泡出現(xiàn)。程應(yīng)防止氣泡出現(xiàn)。 待膠室灌滿后，在凹槽處將鯊魚(yú)齒梳的平齊端插入膠液約待膠室灌滿后，在凹槽處將鯊魚(yú)齒梳的平齊端插入膠液約5 5 mmmm6 mm6 mm，膠聚合時(shí)間不少于，膠聚合時(shí)間不少于1.5h1.5h。 膠聚合后膠聚合后, ,清理膠板表面溢出的膠液清理膠板表面溢出的膠液, ,輕輕拔出梳子輕輕拔出梳

8、子, ,用清水用清水洗干凈備用。洗干凈備用。11PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系2.2.變性變性 取取1010 l l擴(kuò)增產(chǎn)物，加入擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 2 L 6L 6加樣緩沖液，混勻。加樣緩沖液，混勻。 在在PCRPCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行擴(kuò)增儀上運(yùn)行9595變性變性5min5min， 取出立即置于冰上，冷卻取出立即置于冰上，冷卻10min10min以上后供備用。以上后供備用。12PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系3.3.電泳電泳 將膠板安裝于電泳槽上，將膠板安裝于電泳槽上， 電泳正極槽（下槽）加入電泳正極槽（下槽）加入0.50.5TBETBE緩沖液緩沖液600mL600mL，負(fù)極槽（，負(fù)極槽（

9、上槽）加入上槽）加入0.50.5TBETBE緩沖液緩沖液600mL600mL，拔出樣品梳，拔出樣品梳; ; 在在1800V1800V恒壓預(yù)電泳（恒壓預(yù)電泳（10102020）minmin，用塑料滴管清除加樣，用塑料滴管清除加樣槽孔氣泡和雜質(zhì)，將樣品梳插入膠中槽孔氣泡和雜質(zhì)，將樣品梳插入膠中1mm-2mm1mm-2mm。 每一個(gè)加樣孔加入每一個(gè)加樣孔加入5 5 L L變性樣品，在變性樣品，在1800V1800V恒壓下電泳。恒壓下電泳。13PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系4.4.染色染色 將粘有凝膠的長(zhǎng)玻璃板膠面向上浸入將粘有凝膠的長(zhǎng)玻璃板膠面向上浸入“固定固定/ /染色液染色液”中，輕中，輕

10、搖染色槽，使搖染色槽，使“固定固定/ /染色液染色液”均勻覆蓋膠板，染色均勻覆蓋膠板，染色5 min5 min10 10 minmin。 將膠板移入水中漂洗將膠板移入水中漂洗30 s30 s60 s60 s。 再移入顯影液中，輕搖顯影液槽，使顯影液均勻覆蓋膠板，再移入顯影液中，輕搖顯影液槽，使顯影液均勻覆蓋膠板，待帶型清晰，待帶型清晰， 將膠板移入去離子水中漂洗將膠板移入去離子水中漂洗5 min5 min，晾干膠板，放在膠片觀察，晾干膠板，放在膠片觀察燈上觀察記錄結(jié)果，拍照保存。燈上觀察記錄結(jié)果，拍照保存。14PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)體系4.4.數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)增片段大小的讀取，統(tǒng)

11、一采用兩段式數(shù)據(jù)記錄方式。擴(kuò)增片段大小的讀取，統(tǒng)一采用兩段式數(shù)據(jù)記錄方式。 純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/XX/X，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后，缺失位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為，缺失位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為0/00/0。 注注：非純合：非純合SSRSSR位點(diǎn)的數(shù)據(jù)記錄為位點(diǎn)的數(shù)據(jù)記錄為X/YX/Y（其中（其中X X、Y Y 分別為該位分別為該位點(diǎn)兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增片段大?。?。點(diǎn)兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增片段大小）。15五、作業(yè)五、作業(yè) (1) (1)統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果 (2) (2)簡(jiǎn)述簡(jiǎn)述SSRSSR分子標(biāo)記測(cè)定品種真實(shí)性的原理與步驟分子標(biāo)記測(cè)定品種真

12、實(shí)性的原理與步驟 （3)3)實(shí)驗(yàn)后思考實(shí)驗(yàn)后思考16附：試劑配置附：試劑配置A1 DNAA1 DNA提取提?。? 1）0.5 mol/L EDTA0.5 mol/L EDTA溶液溶液NaNa2 2EDTA.2HEDTA.2H2 2O 186.1gO 186.1g溶于溶于800mL800mL水中，加固體水中，加固體NaOHNaOH調(diào)調(diào)pHpH至至8.08.0，加水定容至，加水定容至1000mL1000mL，121121 高壓滅菌高壓滅菌20 min20 min。（2 2）1 mol/L Tris-HCl1 mol/L Tris-HCl溶液溶液TrisTris堿堿 60.55g60.55g溶于適量

13、水中，加溶于適量水中，加HClHCl調(diào)調(diào)pHpH至至8.08.0，加水定，加水定容至容至500mL500mL，121121 高壓滅菌高壓滅菌20 min20 min。（3 3）5 mol/L NaCl5 mol/L NaCl溶液溶液固體固體NaCl 146.1gNaCl 146.1g，加水定容至，加水定容至500mL500mL，121121 高壓滅菌高壓滅菌20 min20 min。17（4 4）CTABCTAB提取液提取液5mol/L NaCl 280 mL5mol/L NaCl 280 mL、20mL -20mL -巰基乙醇（巰基乙醇（C C2 2H H6 6OSOS）、）、CTAB 20

14、gCTAB 20g、1mol/L Tris-HCl 100mL1mol/L Tris-HCl 100mL和和0.5mol/L EDTA 0.5mol/L EDTA 40mL40mL，加水定容至，加水定容至1000mL1000mL，4 4貯存。貯存。（5 5）5 mol/L KAC5 mol/L KAC稱(chēng)取稱(chēng)取KAC 49.67gKAC 49.67g，用水溶解，冰乙酸調(diào)整，用水溶解，冰乙酸調(diào)整PHPH至至5.25.2，定容，定容至至100ml100ml，121121 高壓滅菌高壓滅菌20min20min。（6 6）1 1TE TE 緩沖液緩沖液1mol/L Tris-HCl 5mL1mol/L

15、Tris-HCl 5mL和和0.5mol/L EDTA 1mL0.5mol/L EDTA 1mL，加，加HClHCl調(diào)調(diào)pHpH至至8.08.0，加水定容至，加水定容至500mL500mL，121121 高壓滅菌高壓滅菌20min20min。18A2 PCRA2 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增（1 1）dNTPdNTP用超純水分別配制用超純水分別配制dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP終濃度終濃度100mmol/L100mmol/L的儲(chǔ)存液，分別用的儲(chǔ)存液，分別用0.05mol/L0.05mol/L的的 Tris Tris堿調(diào)整堿調(diào)整PHPH值至值至7.07.0。各取。各取8

16、080 L L混合，用超純水混合，用超純水480480 L L定容至終濃度定容至終濃度10mmol/L each10mmol/L each的工作液。的工作液。（2 2）SSRSSR引物引物用用1 1TETE分別配制上游引物、下游引物終濃度均為分別配制上游引物、下游引物終濃度均為100100 mol/Lmol/L的儲(chǔ)存液，從的儲(chǔ)存液，從100100 mol/Lmol/L的儲(chǔ)存液中吸取上下的儲(chǔ)存液中吸取上下游引物各游引物各12.512.5 L L混合，再加入混合，再加入975975 L 1L 1TETE混勻成混勻成1.251.25 mol/Lmol/L的工作液。的工作液。19A1 A1 電泳電泳(

17、1)(1) 6 6上樣緩沖液上樣緩沖液去離子甲酰胺去離子甲酰胺98mL98mL、0.5mol/L EDTA 2mL0.5mol/L EDTA 2mL、溴酚蘭、溴酚蘭0.25g0.25g和二甲苯青和二甲苯青0.25g0.25g混合搖勻，混合搖勻，4 4備用。備用。(2)(2) 0.5mol/L EDTA0.5mol/L EDTA溶液溶液稱(chēng)取稱(chēng)取18.61 g18.61 g二水合乙二胺四乙酸二鈉（二水合乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na22H2OEDTA-Na22H2O）溶于水中，用）溶于水中，用NaOHNaOH顆粒將顆粒將pHpH調(diào)至調(diào)至 8.0 8.0，加水定容至，加水定容至100 100 mL

18、mL。在。在121 121 滅菌滅菌20 min20 min。(3)(3) 1010TBETBE緩沖液緩沖液(PH=8.3)(PH=8.3)（1000 1000 毫升）：毫升）： 108g 108g Tris baseTris base，55g55g硼酸硼酸 ，7.44gNa2EDTA2H2O7.44gNa2EDTA2H2O，加去離子，加去離子水溶解后定容，室溫保存?zhèn)溆?。水溶解后定容，室溫保存?zhèn)溆谩?0 (4) (4) 6%6%聚丙烯酰胺凝膠母液聚丙烯酰胺凝膠母液(6%(6%膠膠) )（1000 1000 毫升）：毫升）：尿素尿素420g420g、1010TBETBE緩沖液緩沖液50mL50mL、丙烯酰胺（、丙烯酰胺（C3H5NOC3H5NO）57 57 g g、甲叉雙丙烯酰胺（、甲叉雙丙烯酰胺（(H2C=CHCONH)2CH2(H2C=CHCONH)2CH2）3g3g，加水定容，加水定容至至1000mL1000mL。用大漏斗過(guò)濾，所配膠保存在棕色瓶中，置。用大漏斗過(guò)濾，所配膠保存在棕色瓶中，置于于 44冰箱或室溫