麋鹿角醇提液對衰老小鼠細胞因子的影響

1、麋鹿角醇提液對衰老小鼠細胞因子的影響         【摘要】   目的觀察麋鹿角醇提液對D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)衰老模型小鼠細胞因子的影響。方法取ICR小鼠54只，雌雄兼用，隨機分成4組：正常對照組(NG，n=12)，模型對照組(MG，n=14)，麋鹿角醇提液低劑量組(LG，2 g·kg-1·d-1，n=14)，麋鹿角醇提液高劑量組(HG，4 g·kg-1·d-1，n=14)。正常對照組給予背部皮下注射生理鹽水，其余各組用D-半乳糖(D-gal)按120 mg

2、·kg-1·d-1背部皮下注射6周，造成亞急性衰老模型。造模同時，麋鹿角醇提液低劑量組和高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的麋鹿角醇提液，正常對照組和模型對照組給予相同容積的0.5% 羧甲基纖維素鈉(CMC)。采用ELISA法檢測血清中細胞因子IL-2，IFN-的濃度，RT-PCR法檢測脾淋巴細胞IL-2，IFN- mRNA的表達。結(jié)果模型組小鼠血清中IFN-濃度降低，IFN-基因表達水平下降。而麋鹿角醇提液能升高模型組小鼠血清中IL-2和IFN-的濃度，并增強模型小鼠脾淋巴細胞IL-2，IFN- mRNA的表達。結(jié)論麋鹿角醇提液能促進D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠細胞因子IL-2，I

3、FN-的分泌與表達，增強其細胞免疫功能。 【關(guān)鍵詞】   麋鹿角; 衰老模型; D-半乳糖; 細胞因子; 白介素2; 干擾素麋鹿角為鹿科動物麋鹿Elaphurus davidianus Milne-Edwards的骨化老角，又稱麋角。據(jù)古代本草記載，麋鹿角具有“強筋骨、益血脈”，“補元臟、駐顏色”的功效1,2。由于多種原因?qū)е瞒缏乖谖覈呀^滅，幾乎無藥可用。如今，人工繁殖技術(shù)的成功確保了藥用資源和生態(tài)的協(xié)調(diào) ，為麋鹿角恢復(fù)藥用提供了來源。目前，江蘇大豐糜鹿保護區(qū)麋鹿已由1986年的39頭繁殖到1300多頭，并且野生放養(yǎng) 自然 繁殖成功，野生種群數(shù)達100多頭，每年自然脫落下來的麋鹿

4、角也越來越多，現(xiàn)已達3000多公斤，這為其開發(fā)研究提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。 藥 研究發(fā)現(xiàn)麋鹿角的乙醇提取物具有耐疲勞、抗衰老的藥理作用。另外研究還發(fā)現(xiàn)麋鹿角醇提液對正常小鼠體液免疫、細胞免疫功能都有一定的促進作用。但麋鹿角對于衰老小鼠細胞因子是否有影響未見 文獻 報道。本實驗使用D-半乳糖造成亞急性衰老模型，觀察麋鹿角醇提液對衰老小鼠細胞因子的影響，旨在為麋鹿角的開發(fā)利用提供相關(guān)的 科學(xué) 依據(jù)，以盡快恢復(fù)麋鹿角的藥用價值。 1 材料與儀器 1.1 動物ICR小鼠54只，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄兼用，由南通大學(xué)動物實驗中心提供，合格證：SYXK(蘇)2007-0021。1.2 受試藥物

5、配制及試劑麋鹿角，由江蘇大豐麋鹿保護區(qū)提供，將麋鹿角刨片、粉碎成約100目粉末，準確稱取麋鹿角粉末200 g，加入70%乙醇溶液浸泡3次，48 h/次，合并浸泡液并過濾，然后減壓蒸餾，濃縮至80 ml，即為麋鹿角乙醇提取濃縮液，濃度為2.5 g/ml。用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液配制成所需濃度的麋鹿角醇提液備用。D-半乳糖為美國Amerisco公司產(chǎn)品，IL-2與IFN-的ELISA試劑盒為eBioscience公司產(chǎn)品。TRIZOL Reagent，加拿大BBI公司產(chǎn)品。DNA酶(DNase I)，Worthington公司原裝。Oligo(dT)15，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，dATP

6、,dTTP,dCTP,dGTP為Promega公司產(chǎn)品。Taq DNA polymerase為BBI公司產(chǎn)品，DL-2000 DNA Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品。 2 方法 2.1 分組與給藥54只ICR小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量(18±2)g，隨機分成4組：正常對照組(NG，n=12)，模型對照組(MG，n=14)，麋鹿角醇提液低劑量組(LG，2 g/kg，n=14)，麋鹿角醇提液高劑量組(HG，4 g/kg，n=14)。正常對照組按0.1 ml/10g給予背部皮下注射生理鹽水，其余各組用D-gal按120 mg/kg背部皮下注射6周，1次/d，造成亞急性衰老模型。造模同時，麋

7、鹿角醇提液低劑量組灌胃生藥劑量2 g/kg麋鹿角醇提液(0.2 g/ml麋鹿角醇提液，給藥容積0.1 ml/10g)，高劑量組給予灌胃生藥劑量4 g/kg麋鹿角醇提液(0.4 g/ml麋鹿角醇提液，給藥容積0.1 ml/10g)，正常對照組和模型對照組給予相同容積的0.5% 羧甲基纖維素鈉。2.2 ELISA法檢測血清中細胞因子IL-2，IFN-的濃度取待測血清，按eBioscience公司提供的ElISA試劑盒中的方法測定血清中細胞因子IL-2，IFN-的濃度。2.3 RT-PCR檢測脾淋巴細胞IL-2，IFN- mRNA的表達用Trizol常規(guī)提取各組脾淋巴細胞的總RNA，用無RNA酶的D

8、Nase I處理后，按照Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄酶使用說明書合成cDNA第一鏈。然后PCR法分別擴增IL-2，IFN-基因，-actin作為內(nèi)參基因。其引物序列IL-2 上游引物5-aacctgaaactccccaggat-3，下游引物5-tccaccacagttgctgactc-3 預(yù)期擴增長度254bp;IFN-上游引物5-actggcaaaaggatggtgac-3，下游引物5-tgagctcattgaatgcttgg-3，預(yù)期擴增長度為237bp;-actin(肌動蛋白)上游引物 5- gagagggaaatcgtgcgtga -3 ，下游引物5- agtacttgcgctcag

9、gagga -3 預(yù)期擴增長為400bp。PCR總反應(yīng)體系為25l：10×PCR Buffer 2.5l，cDNA1l，引物(上下游混合，各10mol/L)1l, dNTP mix(10mmol/L)0.5 l，MgCl2 (25mmol/L) 2.0 l，Taq酶(5U/l)0.2 l，ddH2O 17.8 l 混勻后稍離心，執(zhí)行PCR程序。PCR反應(yīng)參數(shù)IL-2基因擴增參數(shù)為94 4min，94 35s54 30s72 30s，循環(huán)31次后，在72延伸7min，每管適時加入內(nèi)參-actin引物，內(nèi)參擴增26次。IFN-基因擴增參數(shù)為94 4min，94 35s53 35s72 4

10、0s，循環(huán)31次后，在72延伸7min，每管適時加入內(nèi)參-actin引物，內(nèi)參擴增26次。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)束后使用小源凝膠分析系統(tǒng)拍照獲得凝膠電泳圖像，使用Scion Image圖像分析進行PCR產(chǎn)物條帶分析。為減少誤差，以目的基因與內(nèi)參的比值代替目的基因進行分析。 計算 方法：目的基因條帶灰度相對值=(背景灰度值-目的基因條帶灰度值)/(背景灰度值-內(nèi)參基因條帶灰度值)。2.4 方法數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，采用方差分析，組間比較采用t檢驗。以P0.05作為統(tǒng)計顯著性差異標準。     

11、60;   3 結(jié)果 3.1 血清中細胞因子IL-2，IFN-的濃度見表1。與正常對照組相比，模型組IFN-濃度下降，差異具有顯著性(P0.05)，而IL-2有下降趨勢但未達學(xué)意義(P0.05)。而麋鹿角醇提液低劑量組與高劑量組均能升高模型組小鼠血清中IL-2和IFN-的水平，且均有統(tǒng)計學(xué)意義。表1 麋鹿角醇提取液對D-gal衰老模型小鼠細胞因子的影響3.2 脾淋巴細胞IL-2，IFN- 基因的表達IL-2 mRNA表達如1所示，模型組與正常對照組比較有降低趨勢但差異沒有顯著性(0.551±0.135)vs(0.866±0.251),P0.05,低劑量組

12、與模型組比較有升高趨勢但沒有差異顯著性(0.770±0.069)vs(0.551±0.135),P0.05, 高劑量組與模型組比較，IL-2水平升高1.55倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.855±0.125)vs(0.551±0.135),P0.05。IFN- 基因表達如圖2所示，模型組與正常對照組比較,IFN- mRNA水平顯著下降(0.477±0.058)vs(0.963±0.113),P0.01。而低劑量組與高劑量組均能顯著升高模型鼠IFN-mRNA的表達，其豐度比值分別為2.57倍(1.226±0.146)vs(0.477

13、±0.058),P0.01和3.08倍(1.470±0.092)vs(0.477±0.058),P0.01。 4 討論 麋鹿角為古方記載之傳統(tǒng)補益類名貴中藥， 生藥學(xué)研究證實其含有豐富的氨基酸，維生素以及礦物質(zhì) ，藥 研究也證實麋鹿角醇提液能增強正常小鼠的單核吞噬細胞功能，提高免疫器官的指數(shù)，增強小鼠溶血素形成的能力，提高經(jīng)PHA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，具有增強正常小鼠體液免疫以及細胞免疫功能的作用 。細胞因子(cytokine, CK)是由免疫活性細胞及其相關(guān)細胞(巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞)產(chǎn)生，為具有多種重要生物活性的細胞調(diào)節(jié)蛋白。CK作為細胞間接傳

14、遞信息的分子，參與免疫應(yīng)答的全過程，包括感應(yīng)階段，淋巴細胞活化，增殖、分化階段以及免疫效應(yīng)階段，在免疫調(diào)控中起著重要作用 ，麋鹿角對細胞因子是否有影響還不清楚。本實驗觀察了麋鹿角醇提液對衰老小鼠細胞因子IL-2和IFN-的影響。隨著年齡的增加，免疫器官老化，免疫細胞及細胞因子數(shù)量發(fā)生改變，機體免疫功能逐漸減弱，易發(fā)生感染性疾病、腫瘤、自身免疫病及一些老年病 。D-半乳糖致亞急性衰老已為多方所證實 。D-半乳糖致衰老動物模型對免疫指標的變化與人體衰老指標改變 規(guī)律 基本一致， 文獻 報道D-半乳糖復(fù)制衰老小鼠模型各項免疫指標異常，如免疫器官萎縮，淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力降低，巨噬細胞吞噬功能下降，外周血

15、IL-2含量降低等，較好地反映了衰老的病理特征10 。本實驗使用D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠血清細胞因子IFN-濃度下降且脾淋巴細胞IFN- mRNA表達顯著下調(diào)，說明模型復(fù)制成功。白介素2(IL-2)和 干擾素( interferon gamma, IFN-)都是主要由活化的T 淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用。IL-2具有促進T 細胞增殖分化，增強T 細胞、NK 細胞活性，誘導(dǎo)干擾素生成的作用。IFN- 可增強抗原提呈細胞與T 細胞的相互作用，進而增強T 細胞輔助抗體產(chǎn)生，可活化巨噬細胞，促進其殺傷病原體和腫瘤的能力，并可活化NK 細胞，提高其殺傷能力。IL-2 和IFN- 水

16、平的高低是機體細胞免疫的重要標志11，12 。本研究發(fā)現(xiàn)麋鹿角醇提液能夠升高小鼠血清中IL-2和IFN- 的濃度，并增加小鼠脾淋巴細胞因子IL-2，IFN- mRNA的水平。結(jié)果說明麋鹿角醇提物能基于分子轉(zhuǎn)錄水平增加衰老小鼠脾淋巴細胞IL-2，IFN- 基因的表達，從而促進IL-2以及IFN-的蛋白合成，使其分泌增加，故其在血清中濃度升高。這些反映出麋鹿角醇提液對衰老小鼠的細胞免疫功能有一定的促進作用?！?參考 文獻】 江蘇新院.中藥大辭典M.上海：上海人民出版社，1997：2688.李時珍.本草綱目M.北京：人民衛(wèi)生出版社， 1982：2860.汪銀銀，彭蘊茹，方泰惠.麋鹿角的傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代研究J.現(xiàn)代中藥研究與 2007，22(2)：30.秦紅兵，楊朝曄，朱 清，等.麋鹿角乙醇提取液抗衰老作用研究J.中成藥, 2004，26(4)：322.秦紅兵，楊朝曄，劉紅旗，等.麋鹿角醇提液對正常小鼠免疫功能的影響J.中成藥, 2006，28(12)：1812.張德昌，曹谷珍，唐兆義，等.糜鹿角與鹿角的生藥學(xué)比較J. 中國 中醫(yī)藥信息雜志，2001，8(5)：36.盧次勇，黎大明.鎘對幾種細胞因子的影響J.與健康雜志，1999，16(2)：117.Ginali L,De MartinisM, DOstilio A, et al. The i