黃芩莖葉總黃酮對缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影

1、黃芩莖葉總黃酮對缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影                            作者：龔明玉， 于曉敏， 周曉慧， 楊鶴酶【摘要】  目的觀察黃芩莖葉總黃酮（Scutellaria Baiculensis Stem-leaf Total Flavonoid，SSTF）對缺血再灌注損傷

2、大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支30 min，然后松開再灌注2 h的方法，復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。實驗分為假手術(shù)組、缺血再灌注組（IR），SSTF不同劑量組。采用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）及免疫組化法，檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），Bax和Bcl-2基因蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組AI增加，Bax陽性表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2陽性表達(dá)減弱（P0.01）；與缺血再灌注組比較，SSTF組AI、 Bax陽性表達(dá)下降（P0.05或P0.01），Bcl-2陽性表達(dá)上調(diào)（P0.05或P0.01）。結(jié)論 SSTF能明顯抑制IR引起的心肌細(xì)胞凋亡

3、，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Bax蛋白表達(dá)和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值有一定關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  黃芩莖葉總黃酮 再灌注損傷 細(xì)胞凋亡 基因表達(dá)Abstract：ObjectiveTo observe the effects of total flavonoid(SSTF) in  Scutellaria Baiculensis Stem-leaf on myocyte apoptosis and the expression of apoptosis-associated genes in rat hearts with acute myocardial

4、 ischemia and reperfusion（IR）.MethodsThe left anterior descending branch of coronary artery was ligated for 30 min and reperfused for 2h to make a myocardial ischemia-reperfusion model in rats.The experiment rats were divided into five groups :sham, ischemia-reperfusion(IR),SSTF(17.5，35，70 mg·k

5、g-1·d-1)group. Apoptosis index of(AI) of myocardium was detected by in situ end labeling method,and the protein expression of Bcl-2 and Bax genes cardiomyocytes was shown through immunohistochemistry method.ResultsIn IR group,AI was significantly increased , a protein expression of Bcl-2 gene w

6、as decreased and protein expression of Bax gene was increased.Compared with sham group,SSTF could decrease AI(P0.05，0.01)，up-regulate protein expression of Bcl-2 gene (P0.05，0.01)，and down- regulate protein expression of Bax gene (P0.05，0.01).ConclusionSSTF can significantly inhibit cardiomyocyte ap

7、optosis in ischemia-reperfusion rat hearts.The possible mechanism is to raise the ratio of Bcl-2/Bax proteins by increasing  the expression of bcl-2 gene and decreasing the expression of bax gene.Key words：Total flavonoid in Scutellaria Baiculensis Stem-leaf；  Reperfusion injury；  Apo

8、ptosis ；  Gene expression    近年來，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一1。細(xì)胞凋亡的發(fā)生、受多種基因的調(diào)控，其中凋亡加速基因bax和凋亡抑制基因bcl-2被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)2。本實驗觀察大鼠心肌缺血再灌注時心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，并探討SSTF對心肌缺血再灌注時心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2表達(dá)的影響。1  材料與方法1.1  動物健康SD大鼠40只，體重（230±20）g，雌雄各半（由承德醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）。1.2  藥品、試劑

9、及儀器SSTF純度為61.8%，批號010608，由本院省重點實驗室中藥研究所提供，用飽和NaHCO3溶解配置后灌胃。原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及Bax ，Bcl-2免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。DB-3型心電圖機(jī)，上海光電醫(yī)用儀器有限公司；DW-2000型動物人工呼吸機(jī)，上海嘉鵬科技有限公司；RM-2155型石蠟切片機(jī)，瑞士LeiCa有限公司產(chǎn)品。1.3  大鼠心肌缺血再灌注模型的復(fù)制10%烏拉坦腹腔注射麻醉（1.0 mg/kg），仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖，氣管插管，接人工呼吸機(jī)，呼吸頻率60 次/min，從胸骨左緣34肋間切開

10、胸壁，切開心包膜后，暴露心臟，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針穿過心肌表層在肺動脈圓錐旁出針，將一段直徑2 mm，長5 mm的硅膠管置于結(jié)扎線與心肌之間備用，穩(wěn)定10 min后進(jìn)行實驗。1.4  實驗分組40只SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（sham operation group,SO）：用3號絲線穿過冠狀動脈左前降支，但不結(jié)扎。心肌缺血再灌注組(Ischemia Reperfusion group,IR)：結(jié)扎冠狀動脈左前降支，造成心肌缺血，30 min后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2h，假手術(shù)組和心肌缺血再灌注組于術(shù)前分別給予相應(yīng)容積的生理鹽水，連用1周

11、；SSTF小劑量組(SSTFI組)：手術(shù)前給予SSTF灌胃17.5 mg·kg-1·d-1，連用1周，其余同組。SSTF中劑量組(SSTFII組)：手術(shù)前給予SSTF灌胃35 mg·kg-1·d-1，連用1周，其余同組。SSTF大劑量組(SSTFIII組)：手術(shù)前給予SSTF灌胃75 mg·kg-1·d-1，連用1周，其余同組。    再灌注2 h末，迅速剪下左冠狀動脈前降支支配的左心室心肌，置于10%福爾馬林中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，做凋亡細(xì)胞、bax和bcl-2蛋白表達(dá)的檢測。1.5

12、0; 觀測指標(biāo)1.6  統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件。所有數(shù)值均用±s表示，多組間的比較用方差分析，兩組間比較用q檢驗，P0.05為差異有顯著性。1         2  結(jié)果2.1  SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響光鏡下TUNEL染色可見心肌陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞輪廓清楚，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，壞死區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）在假手術(shù)組、IR組、SSTF組、SSTF組、SSTF組分別為（1.65±0.8）% ，（16.4&#

13、177;2.13）% ，（15.1±2.01）%，（13.5±1.85）%，（12.2±1.56）%，可見缺血再灌注組和SSTF組的凋亡細(xì)胞數(shù)均比假手術(shù)組的多，凋亡指數(shù)均大于假手術(shù)組（P<0.01），IR組與SSTF組相比，前者的AI大于SSTF組、SSTF組（ P0.05或P0.01）。結(jié)果見表1 。2.2  SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2蛋白表達(dá)的影響陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒，Bcl-2蛋白主要分布在線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜等處；Bax表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞漿或松散地附著在細(xì)胞膜上。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組Bax陽性表達(dá)

14、增強(qiáng)，Bcl-2陽性表達(dá)減弱（P0.01）；與缺血再灌注組比較，SSTF組 Bax陽性表達(dá)下降（P0.05或P0.01），Bcl-2陽性表達(dá)上調(diào)（P0.05或P0.01）。結(jié)果見表1。表1  SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2蛋白表達(dá)的影響（略）與假手術(shù)組比較P<0.05, P<0.01;與模型組比較,P<0.05, P<0.01;n=83  討論    以往認(rèn)為MIRI過程中，氧自由基水平升高，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞因子等是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要因素，但是這些因素并不直接引起細(xì)胞凋亡，而是通過

15、一定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式激活相關(guān)基因來調(diào)控細(xì)胞凋亡4，5。參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的基因很多，其中 Bcl-2是調(diào)節(jié)凋亡基因家族的基本成員，Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，Bax基因與Bcl-2基因具有高度的同源序列，是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因6，7，Bcl-2和Bax二者形成了一個凋亡調(diào)控系統(tǒng)：當(dāng)Bax蛋白同源二聚體形成，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；隨Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，越來越多的Bax蛋白二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax-Bax更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2蛋白異源二聚體，從而“中和”了Bax-Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生。因此，過度表達(dá)Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制

16、 Bcl-2的抗凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，IR組AI顯著高于SO組，且缺血再灌注使Bcl-2和Bax的表達(dá)明顯增多，但以Bax的增多更為顯著，使Bcl-2/Bax比值顯著降低，提示Bcl-2和Bax確實參與了缺血再灌注時的心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控。而在缺血再灌注前給予SSTF，Bcl-2表達(dá)增加， Bax表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值升高，同時AI明顯減少。由此推測，SSTF抑制心肌缺血再灌注引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值有一定關(guān)系?！尽?#160; 1 Xie Z,Koyama T,Suzuki J,et al.Coronary reper

17、fusion followings ischemia:different expression of bcl-2 and bax proteins, and cardiomyocyte apoptosisJ.Jpn Heart,2001,42(6)：759.2 Yamamura T,Otani H,Nakao Y,et al . IGF-I differently regulates Bcl-xL and Bax and confers myocardial protection in the rat heart J.Am J Physiol Heart Cire Physiol , 2001

18、,280(3):HI191-HI200.3 阮長武，張代富，汪姍姍，等.黃芪對缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響J.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2003，24(3)：182.4 Vishna K, Steve E. Alterations in immunocyte tumor necrosis factor receptor and apoptosis in patients with congestive heart failureJ.Ann Surg, 2002, 236(2)：254.5 Scarabelli TM ,Stephanou A , Pasini E , et al .Different signaling pathways indu