腫瘤細(xì)胞凍存方法的探討

1、腫瘤細(xì)胞凍存方法的探討曾艷1,付浩2,韋星呈1,師秀艷2(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室,遼寧沈陽(yáng)110034; 2.生物化學(xué)教研室關(guān)鍵詞腫瘤細(xì)胞;瘤株;凍存中圖分類號(hào)R73-35文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B文章編號(hào)1008-2344(200602-0156-01腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)是開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤新藥的常規(guī)手段。腫瘤研究中移植性腫瘤又稱瘤株傳代也是最基本的常用技術(shù)。瘤細(xì)胞培養(yǎng)后和瘤株建成后如何將細(xì)胞系和瘤株保存好是很值得探討的?，F(xiàn)將我們摸索出一套簡(jiǎn)便易行、凍存效果好的腫瘤細(xì)胞凍存方法報(bào)道如下。1冷凍保存時(shí)間與腫瘤細(xì)胞存活率的關(guān)系實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)新的腫瘤細(xì)胞株后,首先要把該腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來(lái)。腫瘤細(xì)胞

2、凍存可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時(shí)有備份可用,另外幾乎所有腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過(guò)程中發(fā)生一定程度的變異,為了保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性,一般腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能使用了,因此需要將凍存的、傳代較少的腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)再使用。冷凍保存溫度指能長(zhǎng)期保存細(xì)胞的超低溫度,在此溫度下,細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止,但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存,在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。不同的細(xì)胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果,冷凍保存溫度可以不同1。但從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā),液氮溫度(-196是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196時(shí),細(xì)胞的生命活動(dòng)幾乎完全停止,但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍

3、過(guò)程得當(dāng),一般生物樣品在-196下均可保存十年以上。應(yīng)用-70 -80保存細(xì)胞,短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響,但隨凍存時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點(diǎn)到-40范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳2。我們采用冷凍保存培養(yǎng)瘤細(xì)胞和瘤株已有近10年的經(jīng)驗(yàn),我們觀察了已凍存的1年、2年、5年及8年以上的瘤細(xì)胞和瘤株,不同凍存條件對(duì)其存活的影響,發(fā)現(xiàn)存放細(xì)胞并不是無(wú)限期的,在液氮中保存細(xì)胞隨著保存年數(shù)的增加,細(xì)胞存活率下降。5年時(shí)細(xì)胞存活率僅為40%55%,所以每5年最好重新將種子細(xì)胞復(fù)蘇后擴(kuò)增再凍存,以確保種子細(xì)胞的存活率。2腫瘤細(xì)胞凍存方法的改進(jìn)冷凍保存瘤細(xì)胞和瘤株要比體內(nèi)、體外傳代保存更為優(yōu)越,瘤細(xì)胞凍存

4、后幾乎沒(méi)有機(jī)械性損傷,可以使培養(yǎng)瘤細(xì)胞和瘤株免遭污染和受宿主不同因素影響而改變生物學(xué)特性,特別對(duì)于那些不常用的但又很重要的細(xì)胞系或剛建株后不能立即用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系及瘤株,低溫保存更為重要。在低于-70的超低溫條件下,有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢,甚至終止。因此,采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖档椭脸蜏?即可使生命活動(dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí),其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存,就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70的超低溫條件,并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。我們凍

5、存細(xì)胞時(shí)將所需凍存的細(xì)胞加入凍存液后直接置于-70冰箱中過(guò)夜,第2d放入液氮中。傳統(tǒng)常規(guī)的細(xì)胞凍存方法需要將凍存的細(xì)胞置于42h,04h,-20過(guò)夜,次日取出懸掛液氮罐口30m in后,下降到液氮中保存3。常規(guī)細(xì)胞凍存方法有許多弊端:當(dāng)冷凍速度過(guò)慢時(shí),細(xì)胞脫水嚴(yán)重,細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮,超過(guò)一定程度時(shí)即失去活性。還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰,從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高,產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。同時(shí)冷凍速度不同也能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化,可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。因此,超快速玻璃化冷凍對(duì)細(xì)胞存活來(lái)說(shuō)是最為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固,無(wú)冰晶形成或形成很小的冰晶,對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損

6、傷,細(xì)胞也不會(huì)在高濃度的溶質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間暴露而受損。不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。我們的細(xì)胞凍存方法與傳統(tǒng)的常規(guī)細(xì)胞凍存方法比較而言,省時(shí)、省力、簡(jiǎn)便易行,更為重要的是細(xì)胞凍存效果好。對(duì)短期(數(shù)周或數(shù)月不用的細(xì)胞可保存于-70低溫冰箱中。但暫時(shí)存放時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),因1年存活率僅為34%,若要長(zhǎng)期保存還應(yīng)放入液氮罐中。由此可見(jiàn),要想獲得凍存細(xì)胞的最大活性,影響因素很多,它們相互影響,相互作用,無(wú)論那一方面均不可忽視。如何更好的長(zhǎng)時(shí)間凍存細(xì)胞又能保存其活性還有待進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn):1王麗英,于鴻.不同種類細(xì)胞培養(yǎng)和凍存方法的改進(jìn)J .實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,1998,12(1:12.2薛慶善.體外培養(yǎng)的原理和技

7、術(shù)M .北京:北京科學(xué)出版社,2001.128-136.3龔守良.實(shí)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)M .吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1990.233-245.收稿日期2005-10-09阿霉素微乳的制備方法孟俐麗1,王俊平2 (沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科研處,遼寧沈陽(yáng)110034;21醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部藥理教研室關(guān)鍵詞長(zhǎng)循環(huán)阿霉素微乳;急性毒性;抗癌作用中圖分類號(hào)R965文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B 文章編號(hào)1008-2344(200602-0157-02阿霉素(doxorubicin,DR 是一種蒽醌類抗生素,用于治療腫瘤,但不良反應(yīng)多且嚴(yán)重1。乳劑中分散微粒大小介于50100nm ,透明或半透明液體的乳劑稱為微乳(m icr oe muls

8、i on ,可作為一種抗癌藥物新劑型。微乳可用于運(yùn)載抗癌藥物,能夠顯著提高藥物的抗癌作用,同時(shí)減輕或減少其不良反應(yīng)2,3。為減輕DR 的不良反應(yīng),同時(shí)提高其療效,我們采用油酸為相,聚乙二醇2二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG 2DSPE 為乳化劑,研制阿霉素微乳(doxo 2rubicin m icr oe mulsi on,DR 2M ,初步評(píng)價(jià)其急性毒性和抗癌效果。1材料與方法1.1材料阿霉素:由海門(mén)制藥廠生產(chǎn);鴉膽子油,由沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥廠提供;PEG -DSPE,購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar L i p ids 公司;昆明種小白鼠,雌雄各半,體重(20±2g,艾氏腹水癌(E

9、AC ,Hep s 腹水型,由課題組所在單位提供;日本島津高效液相色譜系統(tǒng),S LC 26A,附SP D 2G AV 型全波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器;國(guó)產(chǎn)RE52298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;國(guó)產(chǎn)FSH 22A 可調(diào)高速勻漿機(jī);國(guó)產(chǎn)S LJ 21型離心機(jī)。1.2阿霉素微乳的制備制備阿霉素(DR 和油酸(OA 的復(fù)合物(DR 2OA ,與PEG 2DSPE (PEG 分子量:2000一起溶于氯仿,然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器制備脂質(zhì)薄膜。在50的水浴中,將上述脂質(zhì)薄膜用10%葡萄糖水合20m in,轉(zhuǎn)入冰浴中,用高速勻漿機(jī)分散5m in,100n m 微孔濾膜過(guò)濾,即得阿霉素微乳。1.3阿霉素的分析方法采用HP LC 測(cè)定DR

10、 含量,色譜條件是在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,結(jié)合我們的儀器條件而建立的3漿中DR 的提取”項(xiàng)下程序處理樣品,提取上述標(biāo)準(zhǔn)樣品中的DR 。在上述色譜條件下,測(cè)定所提取的DR 的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),血漿中DR 濃度為橫坐標(biāo)X,進(jìn)行線性回歸,得HP LC 測(cè)定血漿中DXR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y =169.96+6508.21X ,r =0.9992。血漿中DR 的平均回收率為87.97%,精密度不超過(guò)4%。1.4血漿中DR 的提取采用提取后測(cè)定法測(cè)定DR 的血漿藥物濃度。提取方法參考文獻(xiàn)方法1。取樣條件:6mg DR /kg 動(dòng)物,靜脈注射單劑量給藥,于不同時(shí)刻取3只動(dòng)物斷頭采血,置肝素抗凝的干燥試管中,按如下程序提取DR:取血漿0.6m l 與0.6m l P BS (pH =9.1