軟骨組織工程種子細(xì)胞源的研究進(jìn)展

1、軟骨組織工程種子細(xì)胞源的研究進(jìn)展                      作者：王翠芳，馮萬文，武天佑 ，孫正義【關(guān)鍵詞】  軟骨組織工程種子細(xì)胞源多種原因造成的關(guān)節(jié)軟骨病變比較常見，軟骨損傷后缺乏自愈能力，軟骨缺損的修復(fù)一直是臨床的難題。隨著細(xì)胞生物學(xué)和材料科學(xué)的迅速發(fā)展，應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)軟骨病損已成為可能，而優(yōu)化種子細(xì)胞源是應(yīng)用這一技術(shù)的前提和關(guān)鍵1。本文就有關(guān)軟骨

2、組織工程種子細(xì)胞源的優(yōu)化獲取、存在的問題及其解決等研究進(jìn)展作一綜述。    1  軟骨組織工程對種子細(xì)胞源的要求    組織工程軟骨的種子細(xì)胞應(yīng)符合下列要求：來源豐富，取材方便；有較強(qiáng)的增殖傳代能力；與載體材料接種后能保持增殖能力和較高的黏附率，植入受區(qū)后能保持修復(fù)組織的表型；對機(jī)體或供區(qū)損傷小，臨床應(yīng)用的生物安全性和無明顯的免疫排斥和其他潛在危險2。    2  軟骨組織工程的種子細(xì)胞源2.1  自體軟骨細(xì)胞    理論上講自體軟骨細(xì)胞是軟骨組

3、織工程最理想的種子細(xì)胞源，不僅功能相同，不存在免疫排斥反應(yīng)，而且不需要誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。但研究表明種子細(xì)胞濃度為(56)×107/ml時，形成的新生軟骨形態(tài)最佳，但是自體軟骨組織取材受限，軟骨細(xì)胞增殖能力低，難以達(dá)到應(yīng)有的細(xì)胞數(shù)量，體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易發(fā)生去分化而失去原有的表型3，因此直接源于自體軟骨組織的種子細(xì)胞，體外單層培養(yǎng)難以獲取大量的細(xì)胞以滿足組織工程對種子細(xì)胞的需求。    為解決上述難題，使用生物反應(yīng)器三維培養(yǎng)可使軟骨細(xì)胞快速擴(kuò)增，建立能夠長期培養(yǎng)、表型穩(wěn)定的永生化軟骨細(xì)胞。生物反應(yīng)器能控制pH、機(jī)械能力、營養(yǎng)供給條件等，為細(xì)胞的生長、分化提供最適宜

4、的環(huán)境。根據(jù)自體軟骨細(xì)胞培養(yǎng)所需的條件，仿生性地設(shè)計接近體內(nèi)環(huán)境的軟骨生物反應(yīng)器，模擬了體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境。相同容積的生物反應(yīng)器比普通培養(yǎng)方式，多出數(shù)10倍甚至上100倍的細(xì)胞?？蓽p少細(xì)胞去分化現(xiàn)象，有利于細(xì)胞表型的維持，提高種子細(xì)胞的質(zhì)量。有利于軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增及表型維持。2.2  同種異體軟骨細(xì)胞    與體內(nèi)其他組織相比，軟骨有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特點(diǎn)。軟骨無血管、淋巴管和神經(jīng)，細(xì)胞包埋在由軟骨基質(zhì)形成的軟骨囊內(nèi)，可阻擋免疫細(xì)胞直接與其接觸，不易被機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊，軟骨基質(zhì)抗原性低，一般不引起或僅有輕微的免疫反應(yīng)，獲取種子細(xì)胞時要經(jīng)過消化分

5、離和體外培養(yǎng)等一系列處理，軟骨細(xì)胞表面抗原可被進(jìn)一步消弱。同種異體軟骨來源廣，易獲取，一次可獲取大量軟骨細(xì)胞，所以同種異體軟骨是值得研究的種子細(xì)胞來源。應(yīng)用同種異體軟骨細(xì)胞作種子細(xì)胞，在具有免疫力動物體內(nèi)形成同種異體工程化軟骨，并用于軟骨缺損修復(fù)的實驗報道，未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)6。研究表明胚胎來源的軟骨細(xì)胞較成體軟骨細(xì)胞引起的異體排斥反應(yīng)微弱，提示在同種異體軟骨組織工程中，胚胎來源的軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞是最佳選擇。對同種異體軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性和相關(guān)免疫反應(yīng)問題的進(jìn)一步研究，將為建立軟骨組織工程種子細(xì)胞庫奠定基礎(chǔ)。2.3  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow?derived

6、mesenchymal stem cells，BMSCs)    骨髓中存在具有向多種細(xì)胞系分化潛能的BMSCs。Friedenstein發(fā)現(xiàn)骨髓中存在少量可以貼壁繁殖的BMSCs，條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)可分化成為軟骨細(xì)胞。Cancedda等8對BMSCs和骨膜細(xì)胞修復(fù)兔股骨髁軟骨全層缺損進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者均能形成軟骨和軟骨下骨。    Butnariu?Ephrat等9用BMSCs復(fù)合聚合物支架，自體和異體移植修復(fù)股骨負(fù)重區(qū)軟骨缺損，結(jié)果自體BMSCs早期形成類透明軟骨，異體BMSCs的免疫反應(yīng)導(dǎo)致后期纖維化和骨關(guān)節(jié)炎改變。Gao等10分

7、別用成骨和成軟骨條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠BMSCs，復(fù)合不同材料的雙層支架植入裸鼠背部皮下，術(shù)后1周檢測新生組織中含有、型膠原，認(rèn)為BMSCs在不同生物活性因子的作用下，結(jié)合相應(yīng)的生物材料可以構(gòu)建出工程化的骨軟骨復(fù)合體，因此，目前認(rèn)為BMSCs是一種比較理想的種子細(xì)胞源。盡管BMSCs只有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能性，但其數(shù)量在全骨髓中僅占1101/10，并且隨傳代次數(shù)的增加，其軟骨分化潛能逐漸降低，必須通過適當(dāng)?shù)目刂茥l件和誘導(dǎo)因素，使BMSCs保持增殖并分化為軟骨細(xì)胞，也有研究表明重癥骨關(guān)節(jié)炎病人BMSCs的成軟骨能力明顯降低11，并且最近研究證實當(dāng)BMSCs培養(yǎng)傳代90次后細(xì)胞發(fā)生癌變，聲

8、稱這符合腫瘤細(xì)胞源于干細(xì)胞的假說，因此對BMSCs應(yīng)用的生物安全性必須引起高度重視和深入研究12。2.4  BMSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)    基于BMSCs和軟骨細(xì)胞均不能完全滿足組織工程對種子細(xì)胞的要求，那么將2種細(xì)胞優(yōu)勢互補(bǔ)，進(jìn)行共培養(yǎng)來優(yōu)化和擴(kuò)大軟骨組織工程的種子細(xì)胞源就成為可供選擇的方式。Tsuchiya等13用不同比例的人BMSCs和牛軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BMSCs數(shù)量比例愈高軟骨細(xì)胞表達(dá)的型膠原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培養(yǎng)前的細(xì)胞比例，因此BMSCs能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和基質(zhì)形成，其原因是共培養(yǎng)系統(tǒng)中BMSCs分泌的活性生長因子(TGF)

9、，通過軟骨細(xì)胞介導(dǎo)自分泌或旁分泌上調(diào)了軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成。Goldberg等14用添加TGF 的培養(yǎng)基培養(yǎng)去分化的軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明添加TGF能使去分化的軟骨細(xì)胞重新分化，從而維持了軟骨細(xì)胞的表型。在構(gòu)建工程化軟骨組織中，利用BMSCs增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，少量軟骨細(xì)胞的微環(huán)境能誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞，比單純軟骨細(xì)胞構(gòu)建的軟骨組織更為成熟，也避免了軟骨細(xì)胞長期培養(yǎng)傳代而導(dǎo)致的老化和去分化，并且節(jié)省了軟骨細(xì)胞的用量。因此BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)對優(yōu)化和擴(kuò)大種子細(xì)胞源可能是一種實用的策略。2.5  軟骨膜細(xì)胞或骨膜細(xì)胞     

10、60;  骨膜和軟骨膜生發(fā)層含未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，在低氧張力、無血供的關(guān)節(jié)腔內(nèi)分化為軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑液和使用CPM是促使間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的有利因素。Wakitani等15培養(yǎng)兔脛骨膜細(xì)胞，修復(fù)兔股骨髁全層軟骨缺損，24周時軟骨下骨完全形成，新生軟骨組織無骨化現(xiàn)象。Chu等16用異體肋軟骨膜細(xì)胞和PLA支架修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損，96的缺損6周時為軟骨填充，型膠原比例隨時間延長而升高，說明關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境刺激新生組織向透明軟骨方向發(fā)展，黏多糖含量12個月時降低，軟骨下骨厚度為正常的50，認(rèn)為異體移植的免疫反應(yīng)和PLA降解產(chǎn)物的酸性環(huán)境影響了軟骨下骨結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致新生軟骨生物力學(xué)性能下

11、降和纖維化。2.6  肌肉源性基質(zhì)干細(xì)胞(muscle?derived stromal cells)    Pate等17使用凍融方法和地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)兔肌源性基質(zhì)干細(xì)胞，形成了軟骨結(jié)節(jié)和含有硫酸黏多糖的細(xì)胞外基質(zhì)。青年和老年人的肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)出現(xiàn)同樣的結(jié)果18。Adachi等19用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或肌源性干細(xì)胞復(fù)合II型膠原凝膠修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損區(qū)，24周后可見缺損區(qū)呈軟骨樣修復(fù)，優(yōu)于不含細(xì)胞的I型膠原凝膠對照組，認(rèn)為肌源性干細(xì)胞取材方便，細(xì)胞倍增時間短，可以作為修復(fù)軟骨損傷的種子細(xì)胞源和基因治療的靶細(xì)胞。2.7  脂肪源性基質(zhì)干細(xì)胞(adi

12、pose tissue?derived stromal cells，ADSC)    為提供更多間充質(zhì)細(xì)胞的自體組織，Erickson等20用型膠原酶消化人吸脂術(shù)中的皮下脂肪，經(jīng)梯度密度離心獲取基質(zhì)干細(xì)胞，使用普通和軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含TGF?撥?1和地塞米松)三維培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下412周取材，免疫組織化學(xué)和RT?PCR檢測表明：軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液體外培養(yǎng)1周和植入裸鼠體內(nèi)的標(biāo)本均有明確的成軟骨特征，而使用普通培養(yǎng)液的對照組則陰性，類似結(jié)果亦見于大鼠脂肪來源的干細(xì)胞21。源于脂肪組織的基質(zhì)干細(xì)胞，因脂肪組織在體內(nèi)廣泛存在，取材方便，對人體造成的創(chuàng)傷相對較小，是

13、目前獲取種子細(xì)胞的新途徑，也是研究的熱點(diǎn)，其細(xì)胞表型與BMSCs非常相似，均表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLA?DR及C?kit表型，同時其增殖能力優(yōu)于BMSCs22。然而Hui等23在修復(fù)軟骨缺損的研究發(fā)現(xiàn)，在相同的實驗條件下其修復(fù)效果不如BMSCs。由于該細(xì)胞為誘導(dǎo)性干細(xì)胞，體外培養(yǎng)時必須在持續(xù)誘導(dǎo)條件下才能分化為軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)難度相對較大并且其成軟骨機(jī)制尚不完全清楚。如能掌握脂肪組織基質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨機(jī)制和性能，在體外培養(yǎng)持續(xù)向軟骨細(xì)胞分化，則不失為一種優(yōu)秀的種子細(xì)胞源24。2.8  胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC) 

14、;   胚胎干細(xì)胞來自早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或尿生殖嵴，胚胎干細(xì)胞是全能干細(xì)胞，可分化為3個胚層的細(xì)胞，種植于體內(nèi)可形成包含三胚層細(xì)胞的畸胎瘤。改變體外培養(yǎng)條件，可使胚胎干細(xì)胞向不同的細(xì)胞系分化，文獻(xiàn)報道胚胎干細(xì)胞在BMP?2和BMP?4的作用下可分化為軟骨細(xì)胞25，胚胎干細(xì)胞與已分化的成熟軟骨細(xì)胞相比，除具有更強(qiáng)的增殖能力外，還具有再生潛能，可維持整個生命過程中細(xì)胞的更新和正常的功能，因而胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞可能更為優(yōu)勢。但使用胚胎干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞，體外培養(yǎng)要求嚴(yán)格，自發(fā)分化難以控制，分化多具致瘤性，安全性難于把握，臨床使用尚存在倫理學(xué)問題。 

15、0;  3  基因修飾的種子細(xì)胞    多種細(xì)胞因子有促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用。通過基因重組技術(shù)，將細(xì)胞因子基因?qū)胲浌羌?xì)胞或相關(guān)細(xì)胞，使之在病損部位分泌生長因子并維持所需的濃度和時間，有效促進(jìn)軟骨的修復(fù)，這就是基因修飾的組織工程技術(shù)(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激軟骨細(xì)胞增殖和型膠原與蛋白多糖的合成。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞可標(biāo)記軟骨細(xì)胞的示蹤。研究表明，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和BMP-4的調(diào)控下，可在體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，同時保留其分泌型膠原等的特性。Sellers等26用

16、含rhBMP?2的I型膠原海綿修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，24周時新生軟骨厚度達(dá)到正常軟骨的70和潮線形成，rhBMP?2組與單純膠原海綿和曠置組間的差異只有統(tǒng)計學(xué)意義，但是外源性生長因子半衰期短，需較大劑量或連續(xù)給藥才能發(fā)揮作用，增加了治療成本。Baragi等以腺病毒攜帶lacZ作為報告基因，人白介素-1受體拮抗物(hIL-1ra)cDNA作為治療基因，用骨關(guān)節(jié)炎軟骨標(biāo)本體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞和小軟骨薄片，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的軟骨基質(zhì)變性，認(rèn)為基因修飾后的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物學(xué)功能，在一定程度上彌補(bǔ)了自體軟骨細(xì)胞供量不足的缺陷，縮短體外培養(yǎng)時間，更好地維持其表型。 &#

17、160;   多項研究表明以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或脂質(zhì)體等作為載體，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞或直接注入病變部位是可行的，基因工程技術(shù)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域可以使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)軟骨修復(fù)的生長因子，但病毒類載體潛在的致畸性、免疫源性以及脂質(zhì)體對種子細(xì)胞的毒性和轉(zhuǎn)染率低等尚需進(jìn)一步改進(jìn)。    4  展望    種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程化軟骨和應(yīng)用研究中的首要環(huán)節(jié)和基本要求，也是保證軟骨組織工程學(xué)持續(xù)性深入研究的前提。影響優(yōu)化軟骨種子細(xì)胞源的因素眾多，目前研究的種子細(xì)胞各具優(yōu)缺點(diǎn)，尚沒有一種細(xì)胞能夠完全滿足

18、軟骨組織工程對種子細(xì)胞的要求，今后需要開發(fā)和挖掘更多的種子細(xì)胞源，并在模擬體內(nèi)的微環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，建立種子細(xì)胞的評價系統(tǒng)，優(yōu)化出理想的種子細(xì)胞，為軟骨組織工程的研究和臨床應(yīng)用提供可靠保證。BMSCs相關(guān)研究和技術(shù)比較成熟，今后的研究重點(diǎn)是如何保證細(xì)胞能在特定的時間內(nèi)定向擴(kuò)增到臨床治療所需的數(shù)量，并避免致瘤性的產(chǎn)生。BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)可能為解決上述問題提供了一種實用的策略，但兩種細(xì)胞間的相互作用機(jī)制尚需進(jìn)行深入研究。目前脂肪基質(zhì)細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究相對滯后，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對其成軟骨機(jī)制和性能也會不斷了解，優(yōu)勢會逐漸顯現(xiàn)。當(dāng)然，種子細(xì)胞的優(yōu)化只是軟骨組織工程學(xué)研究的第

19、一步，今后還要解決細(xì)胞所需載體及細(xì)胞與載體相容性及相互作用等問題，當(dāng)最終運(yùn)用到臨床尚需考慮免疫排斥性問題?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Landis WJ,Jacquet R,Hillyer J, et al.The potential of tissue engineering in tissue engineering in orthopedicsJ.Othop Clin N(Am)，2005，36(1)：97-104.2 Vats A，Tolley NS，Polak JM.The stem tell in orthopaedics surgeryJ.J Bone Joint Surg(B

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