體外抗體形成細胞的檢測—定量溶血分光光度計法（QHS）

1、1體外抗體形成細胞的檢測體外抗體形成細胞的檢測定量溶血分光光度計法定量溶血分光光度計法(QHS)(Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination) 2v用綿羊紅細胞（用綿羊紅細胞（SRBCSRBC）免疫）免疫小鼠，然后將免疫活性細胞小鼠，然后將免疫活性細胞（小鼠脾臟（小鼠脾臟B B淋巴細胞）、淋巴細胞）、SRBCSRBC和補體在液相介質(zhì)中進和補體在液相介質(zhì)中進行反應(yīng)。行反應(yīng)。SRBCSRBC與抗體形成細與抗體形成細胞所產(chǎn)生的胞所產(chǎn)生的IgMIgM結(jié)合形成抗結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，原抗體復(fù)合物，激活補體系激活補體系統(tǒng)統(tǒng)，裂解，裂解S

2、RBCSRBC而釋放出血紅而釋放出血紅蛋白，以分光光度計定量測蛋白，以分光光度計定量測定。所測值反映了抗體形成定。所測值反映了抗體形成細胞產(chǎn)生抗體的功能。細胞產(chǎn)生抗體的功能。SRBC脾臟脾臟B B細胞細胞SRBC補體補體補體經(jīng)典激活途徑補體經(jīng)典激活途徑SRBC裂解裂解分光光度計檢測分光光度計檢測3實實 驗驗 步步 驟驟vSRBCSRBC及其制備及其制備 脫纖維防凝處理的脫纖維防凝處理的SRBCSRBC，以，以NSNS洗滌二次，洗滌二次，每次每次2000rpm 2000rpm 離心離心5min5min。棄上清，制成。棄上清，制成SRBCSRBC懸液，然后用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，最后懸液，然后用血

3、細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，最后稀釋成稀釋成1.51.510108 8 sRBC sRBC/ml/ml。4補體補體v新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBCSRBC吸收后，用吸收后，用RPMI1640RPMI1640稀釋。稀釋。v（方法在新鮮的豚鼠血清中加入經(jīng)洗滌（方法在新鮮的豚鼠血清中加入經(jīng)洗滌3 3次的次的壓積壓積SRBCSRBC，按血清與，按血清與SRBCSRBC體積比為體積比為5:15:1加入。加入。44吸收吸收30min30min后，后，3000rpm3000rpm離心離心15min15min，吸出，吸出的上清即為的上清即為RBCRBC吸收的豚鼠血清。臨用前吸收的豚鼠血清。臨用前1

4、1：1010稀釋。）稀釋。）5免疫小鼠脾細胞的制備免疫小鼠脾細胞的制備v1 1）免疫鼠制備：取上述稀釋的）免疫鼠制備：取上述稀釋的SRBCSRBC，經(jīng)尾靜脈或腹腔，經(jīng)尾靜脈或腹腔內(nèi)注射免疫小鼠內(nèi)注射免疫小鼠 （鼠齡（鼠齡8 81010周），每只周），每只0.2ml0.2ml。v2 2）取脾臟：）取脾臟：7272小時拉頸處死，取出脾臟用小時拉頸處死，取出脾臟用HanksHanks液清洗，去除脂肪和結(jié)締組織。液清洗，去除脂肪和結(jié)締組織。v3 3）收取脾細胞：）收取脾細胞：v在在200200目銅網(wǎng)上研磨，并用含目銅網(wǎng)上研磨，并用含5%5%小牛血清的冷小牛血清的冷HanksHanks液液沖洗，制備單個

5、脾細胞懸液，轉(zhuǎn)移濾液至試管內(nèi)。沖洗，制備單個脾細胞懸液，轉(zhuǎn)移濾液至試管內(nèi)。1500rpm1500rpm離心離心5min5min。v用含有用含有5%5%小牛血清的小牛血清的HanksHanks液洗滌一次，用液洗滌一次，用1.2ml 1.2ml HanksHanks液重懸細胞。液重懸細胞。6正式實驗正式實驗脾細胞懸液脾細胞懸液SRBC懸液懸液補體補體Hanks液液總體積總體積對照管對照管1ml1ml1ml3ml實驗管實驗管1ml1ml1ml3ml1. 1. 取兩支試管，標(biāo)記取兩支試管，標(biāo)記2. 2. 按下表加試劑按下表加試劑3. 3. 混勻，混勻，3737水浴水浴1 1小時。小時。4. 3000r

6、pm 4. 3000rpm 離心離心 5 min5 min，取上清，取上清5.7215.721分光光度計測分光光度計測413nm413nm處處ODOD值（值（HbHb量）量）7v注意事項：注意事項：v1.SRBC1.SRBC要新鮮，無溶血。要新鮮，無溶血。v2.2.離體脾細胞的制備過程要迅速，以防細胞離體脾細胞的制備過程要迅速，以防細胞死亡，細胞計數(shù)應(yīng)準(zhǔn)確。死亡，細胞計數(shù)應(yīng)準(zhǔn)確。v3.3.紅細胞裂解是本實驗的關(guān)鍵，應(yīng)用力吹打，紅細胞裂解是本實驗的關(guān)鍵，應(yīng)用力吹打，時間也要嚴(yán)格控制。時間也要嚴(yán)格控制。8RBCRBCWBCWBCWBCWBCWBCWBCWBCWBC1mm1mm1mm1mm細胞濃度細

7、胞濃度/ml/ml = 4 = 4個大方格中的細胞總數(shù)個大方格中的細胞總數(shù)/4 /4 10 104 4細胞濃度細胞濃度/ml/ml= 5= 5個中方格中的細胞總數(shù)個中方格中的細胞總數(shù) 5 5 10104 491mm1mm0.1mm=0.1mm3=0.110-3ml =10-4ml細胞濃度細胞濃度:細胞數(shù)細胞數(shù)/ml =5個中格的細胞數(shù)個中格的細胞數(shù) 5104（RBC計數(shù)法）計數(shù)法）細胞數(shù)細胞數(shù)/ml = 4個大格的細胞總數(shù)個大格的細胞總數(shù)/4 104 （WBC計數(shù)法）計數(shù)法）WWWW1mm10抗體制備原理：原理： 抗原免疫小鼠，激活免疫系統(tǒng)，抗原免疫小鼠，激活免疫系統(tǒng)，B B細胞活化并分化為漿細胞，產(chǎn)生針對特細胞活化并分化為漿細胞，產(chǎn)生針對特定抗原的特異性抗體。定抗原的特異性抗體。11方法方法v1.1.用移液管吸取脫纖維防凝處理的綿羊血適量用移液管吸取脫纖維防凝處理的綿羊血適量v2.2.加加2-32-3倍體積生理鹽水，混勻，倍體積生理鹽水，混勻，2000rpm2000rpm離心離心5 5分鐘，小心吸盡上清。分鐘，小心吸盡上清。v3.3.重復(fù)第二步操作。重復(fù)第二步操作。v4.4.用生理鹽水配用生理鹽水配20%20%、25%2