肌動蛋白的克隆與鑒定

1、肌動蛋白的克隆與驗證李亞楠 鄒曾陽 孟冠奇 李軍 張建忠 沈彤摘要：Actin即“肌動蛋白”，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。Actin在不同物種之間高度保守，以至于很難獲得較好的針對actin的抗血清。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括-skeletal muscle actin，-cardiac muscle actin，-smooth muscle actin，和-smooth muscle actin；其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括-actin(-non-muscle)和-non-muscle actin。1-Actin是橫紋肌肌纖維中的一種主要蛋白質(zhì)成分，也

2、是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分。具有收縮功能，分布廣泛。-Actin是PCR常用的內(nèi)參，-Actin抗體是Western Blot很好的內(nèi)參指數(shù)。內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白。它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。2 本次實驗主要通過PCR的手法來擴(kuò)增目標(biāo)蛋白。通過組織細(xì)胞提取DNA，用瓊脂凝膠電泳來驗證是否得到目標(biāo)DNA；回收后的目標(biāo)DNA 用PCR儀擴(kuò)增，并用電泳進(jìn)行回收；與T載體（PUD-18T）連接；用培養(yǎng)的大腸桿菌DH-5a來制備感受態(tài)細(xì)胞；將制備完成的感受

3、態(tài)細(xì)胞均勻的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培養(yǎng)基平板中進(jìn)行藍(lán)白斑的篩選；最后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)驗證后保藏菌種。關(guān)鍵詞：-肌動蛋白 橫紋肌 蛋白質(zhì) PCR1材料與方法1. 1 組織細(xì)胞DNA提取。31.1.1 試劑：細(xì)胞裂解緩沖液、蛋白酶K、TE緩沖液、酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸銨。 器材：膠頭滴管、離心機(jī)、燒杯、動物組織、研缽、水浴。1.1.2 方法 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g，盡量剪碎，置于石英研缽中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入蛋白酶K20微升，混勻。在65恒溫水浴鍋中水浴20min，間歇震蕩離心管

4、數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。 加2倍體積的異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100微升吸頭挑出晾干，用200微升TE重新溶解。 加等量的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）振蕩混勻，離心12000rpm 5min。 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/l乙酸銨，加入2倍體積的無水乙醇，混合后室溫沉淀2min,離心12000rpm 10min。 小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。 用1ml 70乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000rpm 5min。 小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余

5、液滴除掉，室溫干燥。 加200微升TE重新溶解沉淀物，然后置于4或-20保存?zhèn)溆谩?.2 PCR擴(kuò)增1.2.1 器材：PCR儀、移液槍、上下引物、去離子水、反應(yīng)緩沖液，模板DNA、組織DNA1.2.2 方法 在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性（高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈。）、退火（低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合）、延伸（中溫延伸，DNA聚合酶催化引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)與），體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA 在PCR管中依次加入下列溶液：PCR預(yù)混液12.5微升、去離子水9.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升、組織DNA1微升。共

6、計25微升體系 設(shè)置PCR反應(yīng)程序： 94 5min 94 30s 58 30s 32個循環(huán) 72 1min 72 8min1.3電泳儀器：水平電泳槽.電泳儀.凝膠成像分析系統(tǒng).微波爐.微量移液器.透明膠帶.點樣板.100ml或250ml錐形瓶.量筒.吸頭等。 試劑：50x TAE.Tris溶液.冰乙酸.EDTA溶液.去離子水.1xTAE緩沖液.瓊脂糖.溴化乙啶貯存液.溴化乙啶.溴酚藍(lán).二甲苯青.甘油.其他：DNA樣品.DNA Ladder。1.3.2方法 稱取1.5g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入150ml1xTAE瓶口倒扣小燒杯100加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻即成10瓊脂糖凝膠液。 膠板

7、制備：取電泳槽內(nèi)有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈，晾干.放入制膠玻璃板，取透明膠帶將玻璃板與槽兩端邊緣封好形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置并在固定位置放好梳子，將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠完全凝固垂直輕拔梳子、取下膠帶、將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中，添加1xTAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。 加樣：在點樣板上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1x。用10微升微量移液槍分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品應(yīng)該更換一個加樣頭以防污染，加樣時勿碰壞樣品周圍的凝膠面。 電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100v。樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動，電壓升高瓊脂

8、糖凝膠的有效分離范圍降低，當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1處時停止電泳。 觀察照相：在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。 瓊脂糖凝膠電泳回收 按電泳回收試劑盒操作，回收電泳。1.4 感受態(tài)細(xì)胞與T載體的連接1.4.1 設(shè)備：移液器、離心機(jī)、感受態(tài)細(xì)胞、T載體1.4.2 方法PUD-187 微升回收純化的DNA 2微升或3-4微升，看具體濃度。 加水補(bǔ)至5微升，再加入5毫升SOLUTION1，冰上助融。共10微升在16攝氏度放置30分鐘，之后4攝氏度過夜。1.5 細(xì)菌轉(zhuǎn)化1.5.1 設(shè)備 LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基，抗生素，氨芐青霉素，配成100mg/ml，

9、備用，0.1mol/L.CaCl2aq.接種針移液管，培養(yǎng)皿，凈化工作臺，搖床，恒溫水浴鍋，離心機(jī)。X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-D半乳糖)X-gal溶于N，N-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。-20避光保存，IPTG（異丙基-D半乳糖苷）0.2g/ml分裝貯存于-20，氨芐青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml滅菌水中。配成母液保存于-201.5.2 方法LB液體培養(yǎng)基： 胰蛋白酶1g，酵母粉2克，氯化鈉1克，pH7.2-7.4（分裝，20毫升/250毫升，三角瓶，3毫升試管0.07兆帕高壓滅菌30分鐘）。LB固體培養(yǎng)基： LB液體培養(yǎng)基加入1.6%瓊脂

10、粉即可。（分裝50毫升/250毫升，三角瓶，加入8克瓊脂粉0.07兆帕高壓滅菌30分鐘）。 1mol/l氯化鈣（稱取1.1克無水氯化鈣，溶于90毫升蒸餾水，定容100毫升，裝在250毫升三角瓶，0.07兆帕高壓滅菌30分鐘，4攝氏度保存）。 從-70攝氏度冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，放入冰水中融化，放置大約10分鐘。 用冷卻后無菌吸頭將連接好的DNA混合液加入到感受態(tài)細(xì)胞中（每100微升感受態(tài)細(xì)胞加連接產(chǎn)物5微升）旋轉(zhuǎn)混合內(nèi)容物，在冰上放置30分鐘 在將離心管放置于42攝氏度水浴鍋熱激90秒，切勿搖動試管。 迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中，令細(xì)胞冷卻1-2分鐘。 每管加400微升的LB液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到37攝氏度

11、搖床溫浴45分鐘，轉(zhuǎn)速不超過125轉(zhuǎn)，使得細(xì)胞復(fù)蘇（一般4-5小時菌液才能渾濁），搖完后4000轉(zhuǎn)每分鐘離心2-3分鐘，棄去上清液200微升，使菌液濃度增加，用槍吹打后，再涂平板。平板準(zhǔn)備 在40微升 X-gal（中加入4微升 IPTG充分混合，在無菌條件下涂布于含AMP（濃度50微升每毫升）的LB平板上將平板至于37恒溫箱中2-3h，意識培養(yǎng)基充分吸收色素底物X-gal。涂板 將轉(zhuǎn)化菌在無菌條件下涂布于含抗生素和X-gal IPTG的平板上正面朝上放置30分鐘，待菌液完全被吸收后倒置平板。37培養(yǎng)12-18h1.6驗證PCR擴(kuò)增實驗實驗材料：儀器：吸頭，PCR儀器，移液槍材料PCR預(yù)混液12

12、.5微升，水9.5微升，上游引物1微升，下游引物1微升，組織DNA1微升實驗內(nèi)容及步驟：1配制25微升反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液中模板RNA 1微升上游1微升 下游引物1微升，PCR預(yù)混液12.5微升，ddH2O0.95微升。2.設(shè)置PCR反應(yīng)程序3強(qiáng)變性 94攝氏度 5分鐘變性 94攝氏度 30秒退火 58攝氏度 30秒延伸 72攝氏度 1分鐘最后延伸 72攝氏度 8分鐘共32 個循環(huán)1. 上樣啟動反應(yīng)程序2. 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測（取5毫升）電泳實驗所用設(shè)備：水電泳槽，電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，微波爐，微量移液器，透明膠帶，點樣板，錐形瓶，量筒，吸頭。50XTAE,Tris溶液，

13、EDTA 溶液，去離子水，1XTAE緩沖液瓊脂糖溴化乙叮貯存液，溴化乙啶，溴酚藍(lán)，甘油，其他,DNA 樣品。實驗內(nèi)容及步驟：1. 瓊脂糖凝膠電泳的制備：稱取1.5克瓊脂糖置于錐形瓶中，加入150毫升 1XTAE 瓶口倒扣小燒杯100攝氏度加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成百分之1瓊脂糖凝膠液。2. 膠板制備：取電泳槽內(nèi)有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗干凈晾干，放入制膠玻璃板，取透明膠帶將玻璃板與槽兩端邊緣封好形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并固定位置放好梳子，將冷卻到65攝氏度左右的瓊脂糖凝膠完全凝固垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠劑內(nèi)槽放入電泳槽中，添加1XTAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。3. 加樣：在點樣

14、版上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1x，用1微升微量移液管槍分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品應(yīng)更換一個加樣頭，以防止污染，加樣時五碰壞樣品周圍的凝膠面。4. 電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100伏特，樣品由負(fù)極向正極方向移動，電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離，范圍降低，當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1CM處時，停止電泳。5. 觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。1.6.3藍(lán)白斑篩選4設(shè)備：培養(yǎng)皿，移液器，x-gal，IPTG，氨芐青霉素藥品配置：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖

15、）:X-gal溶于N，N-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。-20避光保存，IPTG（異丙基-D半乳糖苷）0.2g/ml分裝貯存于-20，氨芐青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml滅菌水中。配成母液保存于-20IPTG(異丙基-D半乳糖苷):0.2g/ml分裝，貯存于-20攝氏度氨芐青霉素（Ampicillin）1g Ampicillin溶于5ml滅菌水中，配成母液，保存于-20攝氏度步驟：平板制備：在40微升x-gal中加入40微升IPTG，充分混合，在無菌條件下涂布于含有AMP的LB培養(yǎng)基平板上，將平板至于37攝氏度恒溫箱中2-3小時，以使培養(yǎng)基充分吸收色素底

16、物x-gal。涂板：轉(zhuǎn)化菌在無菌的條件下涂布于含抗生素和x-gal，IPTG的平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被吸收后倒置平板37攝氏度培養(yǎng)12-18小時。結(jié)果與分析本次試驗成功提提取目的基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后進(jìn)行電泳，觀察到熒光帶一條處在100200bp之間，另一條熒光帶處在400bp。處在400bp的原因可能是因為在進(jìn)行PCR過程時溫度沒有達(dá)到目的要求。在進(jìn)行藍(lán)白斑驗證時因為沒有及時的涂勻氨芐青霉素而導(dǎo)致培養(yǎng)基中心青霉素濃度高，沒有生長菌落。沒有加入X-gal和IPTG的平板中分別挑取三個菌落放入液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，共5個試管有三個試管長菌，原因可能是另兩個沒有接入菌落。質(zhì)粒提取后行電泳驗證，電泳表現(xiàn)出兩條熒光帶，證明實驗成功。實驗過程中我組組員認(rèn)真嚴(yán)謹(jǐn)?shù)匕凑諏嶒炓蟮倪M(jìn)行試驗，齊心完成實驗，從