人肺癌裸小鼠模型活體成像的動(dòng)態(tài)觀察

1、人肺癌裸小鼠模型活體成像的動(dòng)態(tài)觀察閆明霞1，吳海燕2，朱淼鑫1，劉蕾1，莢德水1，孔韓衛(wèi)1，姚明1 （1.上海市腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)病理研究室，上海 200032；2.揚(yáng)州大學(xué)，揚(yáng)州 225009）摘要 目的：建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌細(xì)胞系，并探討小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)在皮下移植瘤模型中的應(yīng)用。方法：應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法建立表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌細(xì)胞系NCI-H460-GFP,并接種至裸小鼠體內(nèi)建立皮下移植瘤模型，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)連續(xù)5周觀察腫瘤在動(dòng)物皮下的動(dòng)態(tài)生長情況。結(jié)果：建立了轉(zhuǎn)染率接近100%的NCI-H460-GFP細(xì)胞系，在體外及裸小鼠體內(nèi)均能夠長期穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。

2、活體熒光成像觀察發(fā)現(xiàn)：1-4周隨著腫瘤體積逐漸增大，平均熒光量子數(shù)也逐漸增加，5周時(shí)隨著腫瘤出現(xiàn)明顯壞死，平均熒光量子數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論：穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H460-GFP細(xì)胞系及其動(dòng)物模型可以為肺癌研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠客觀定量評價(jià)腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)的生長情況。 關(guān)鍵詞 人肺癌；活體成像系統(tǒng)；裸小鼠；綠色熒光蛋白;慢病毒載體Dynamic observation of in vivo biofluorescence imaging of GFP-transfected human lung carcinoma in nude miceYAN Ming-x

3、ia1, Wu Hai-yan2,Zhu Miao-xin1,Liu Lei1, Jia De-shui1,Kong Han-wei1, YAO Ming1 (1. Department of Experimental Pathology，Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China；2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)ABSTRACT Objective：To establish a human lung carcinom

4、a cell line, which can stably express green fluorescent protein, and discuss the application of in vivo biofluorescent imaging system in animal model. Methods：Human lung carcinoma NCI-H460 cells were tranfected with gfp gene by lentiviral vector, and they were transplanted into the subcutaneous of t

5、he nude mice for preparing the tumor-bearing mice. The biofluorescent signals were detected in sequential five weeks using in vivo fluorescent imaging system. Results：We had successfully built up a human lung carcinoma NCI-H460-GFP cell line, which can display stable high-level GFP expression in vit

6、ro and in vivo. In vivo fluorescent images showed that the fluorescent intensities gradually increased with the increase of tumor volume in nude mice from one week to four weeks, whereas fluorescent intensities didnt agree with caliper-measured tumor volume in the fifth week. Conclusions：This high G

7、FP-expressing cell line and animal model may be useful for the study of lung carcinoma, and in vivo fluorescent imaging system was fitted for evaluation and quantitation of the tumor growth. KEY WORDS： Human lung carcinoma; In vivo imaging system; Nude mice； Green fluorescent protein; lentiviral vec

8、tor活體成像技術(shù)是近幾年新興的一項(xiàng)技術(shù)，它是利用活體生物發(fā)光或熒光成像技術(shù)直接監(jiān)測活細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)行為及跟蹤分子信號(hào)，是檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞及分子事件的強(qiáng)有力手段，目前已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等1-5研究領(lǐng)域發(fā)展最迅速的前沿技術(shù)。國內(nèi)在活體成像技術(shù)方面的工作剛剛起步，相關(guān)技術(shù)尚不成熟。本實(shí)驗(yàn)旨在建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌NCI-H460-GFP細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，應(yīng)用活體成像技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在體內(nèi)、外的熒光表達(dá)情況，為肺癌的深入研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料及客觀的參考依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1人肺癌細(xì)胞株人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460來源于國家癌基因及相關(guān)基因重

9、點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，該細(xì)胞在體外用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級BALB/cnu/nu裸小鼠7只，68周，體重1822g，雄性，由上海市腫瘤研究所提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)20070001，實(shí)驗(yàn)操作及動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格按照SPF級標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(滬)20070001。1.1.3儀器和試劑小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)購自德國Berthold Technologies GmbHCo.KG，型號(hào)為LB983 NC320，分析軟件為WinLight32。熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司。來源于人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的慢病毒載體系統(tǒng)的

10、3種包裝質(zhì)粒PWPXL-GFP、PAX2、PMD2G均來自tronolab公司。胎牛血清購自HyClone公司（Lot No.：NSF0050），培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購自Greiner Bio-one GmbH。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒包裝：將293T細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)皿，每10cm培養(yǎng)皿含2-2.5106個(gè)細(xì)胞，第二天進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。3種質(zhì)粒PWPXL-GFP 20g，PAX2 15g， PMD2G 6g加水至500ul，加入500ul 2xHBS，混勻。加入50ul 2.5M CaCl2，輕輕混勻，室溫放置20-25分鐘后滴加入培養(yǎng)基中。6-8小時(shí)后，更換培養(yǎng)基。第四天收集培養(yǎng)基，

11、3000rpm室溫離心5分鐘，0.45 m濾膜抽濾。病毒可直接用于轉(zhuǎn)染或-70度保存。病毒感染：將NCI-H460細(xì)胞鋪于24孔板，每孔2104個(gè)細(xì)胞。將Polybrene 加入24孔板中，終濃度為4g/ml。加入慢病毒，MOI=1000。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)。1.2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活體熒光成像檢測取生長旺盛的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）常規(guī)消化，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，按50l體積含10，100，1000，1104，5104，1105，5105，1106個(gè)細(xì)胞依次滴加于黑色遮光紙，活體熒光成像系統(tǒng)（發(fā)射波長為520nm，激發(fā)波長為480nm，曝光時(shí)間

12、為1s）檢測各細(xì)胞濃度的熒光表達(dá)情況。1.2.3 腫瘤體內(nèi)生長的活體熒光成像觀察收集生長旺盛的連續(xù)傳代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1107個(gè)/ml，分別取0.2ml接種于3只裸小鼠右背側(cè)近腋部皮下。當(dāng)皮下移植瘤長至直徑約10左右時(shí)剝?nèi)〕鲆浦擦觯蕹w維包膜及出血壞死部分，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，將其剪切成若干1.51.51.5的小塊，用20號(hào)套管針將腫瘤小塊逐個(gè)移植至其他4只裸小鼠皮下，從而建立皮下移植瘤模型。每周游標(biāo)卡尺測量皮下移植瘤直徑，計(jì)算移植瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測GFP表達(dá)的發(fā)射波長為520nm，激發(fā)波長為480nm，曝光時(shí)間為1s。每周觀察皮下移植

13、瘤生長情況，并定量分析各時(shí)間點(diǎn)的熒光值，連續(xù)觀察5周。以腫瘤接種天數(shù)為橫坐標(biāo)，腫瘤接種部位單位面積熒光值為縱坐標(biāo)，繪制皮下腫瘤生長曲線。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將所有數(shù)據(jù)用SAS8.2軟件進(jìn)行處理，相關(guān)性采用SPEARMAN等級相關(guān)進(jìn)行分析，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。計(jì)量資料以均值標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。熒光值按公式：平均熒光量子數(shù)=總量子數(shù)/熒光面積進(jìn)行計(jì)算。移植瘤體積按公式：V=ab2 /2(V為瘤體積，a為長徑，b為短徑) 進(jìn)行計(jì)算。2 結(jié)果2.1 GFP標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞GFP標(biāo)記的NCI-H460細(xì)胞為多邊形上皮樣細(xì)胞，貼壁生長，熒光顯微鏡觀察可見細(xì)胞表達(dá)的熒光信號(hào)較強(qiáng)，熒光較為均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞

14、內(nèi)，轉(zhuǎn)染率接近100%，細(xì)胞在體外能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，并且隨體外長期傳代培養(yǎng)無明顯消退（圖1）。 圖1 穩(wěn)定高表達(dá)GFP的NCI-H460-GFP細(xì)胞(A) NCI-H460-GFP細(xì)胞熒光圖（200） (B) NCI-H460-GFP細(xì)胞明場圖（200）Fig1 Stable and highlevel GFP expression NCI-H460-GFP ceils in vitro(A)Image of NCI-H460-GFP cells visualized with an inverted fluorescence microscopy(200magnification).

15、 (B)Image of (A) visualized with an inverted microscopy(200magnification).2.2活體熒光成像檢測NCI-H460-GFP的體外表達(dá)通過活體熒光成像系統(tǒng)觀察NCI-H460細(xì)胞不同濃度的熒光表達(dá)，結(jié)果可見：該成像系統(tǒng)能夠檢測的最小細(xì)胞數(shù)為100個(gè)腫瘤細(xì)胞，儀器靈敏度較高，隨著細(xì)胞濃度的遞增，熒光表達(dá)的強(qiáng)度也逐漸增加，即平均熒光量子數(shù)與細(xì)胞濃度成正比(圖2)。A B C圖2 活體熒光成像系統(tǒng)觀察不同濃度細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)(A)不同濃度NCI-H460-GFP細(xì)胞活體成像偽彩圖 (B) 不同濃度NCI-H460-GFP細(xì)胞

16、活體成像軟件分析參考圖 (C) 不同濃度NCI-H460-GFP細(xì)胞熒光定量Fig.2 GFP expression of NCI-H460 with different cells concentrations in vitro observed by in vivo biofluoresent imaging system(A)Pseudo-color image of NCI-H460-GFP cells with different cells concentration .(B)Reference image of dimensional distribution and relat

17、ive amplitude of fluorescence drown by Winlight 32 software. (C) Quantification of fluorescence of NCI-H460-GFP cells. 2.3活體熒光成像動(dòng)態(tài)觀察NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生長NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生長潛伏期約5天，1周時(shí)腫瘤大小不能用游標(biāo)卡尺測量，2周時(shí)腫瘤進(jìn)入對數(shù)生長期，至5周時(shí)移植瘤體積可達(dá)（3782.00852.89）3，4只動(dòng)物皮膚表面都出現(xiàn)了不同程度的壞死。應(yīng)用小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)可監(jiān)測到綠色熒光在裸小鼠皮下的穩(wěn)定表達(dá)，從第1周至第4周，隨

18、著腫瘤移植時(shí)間的增加，表達(dá)綠色熒光的面積逐漸增大，熒光量子數(shù)也逐漸增加，移植瘤體積與熒光量子數(shù)成正相關(guān)（R=0.86713,P0.05）（圖3，4，5）。 1w 2w 3w 4w 5w圖3 活體熒光成像動(dòng)態(tài)檢測NCI-H460-GFP細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的表達(dá)Fig.3 Dynamic observation of in vivo biofluorescent imaging of the NCI-H460-GFP tumor in four nude mice from 1 week to five weeks圖4 NCI-H460-GFP的腫瘤生長曲線與與熒光值的動(dòng)態(tài)變化Fig. 4 The

19、tumor growth curve of NCI-H460-GFP and dynamic change of biofluorescence圖5腫瘤體積與熒光值的相關(guān)性分析Fig. 5 The correlation analysis between tumor volume and biofluorescence during tumor proliferation討論活體熒光成像技術(shù)自從出現(xiàn)以來已經(jīng)成為了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的強(qiáng)有力的手段。與之密切相關(guān)的活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)也得到了越來越快速的發(fā)展。1994年Chalfie6等首次在大腸桿菌和線蟲中表達(dá)了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河，近年

20、來，綠色熒光蛋白已成為應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記性蛋白質(zhì)之一。與-半乳糖苷酶（LacZ）、螢火蟲熒光素酶（Luc）等報(bào)告基因相比，gfp基因表達(dá)的綠色熒光蛋白受到藍(lán)光或紫光照射時(shí)可自發(fā)地發(fā)出綠色熒光，熒光信號(hào)強(qiáng)度高，易于被捕獲，無需其他底物或輔助因子的協(xié)助便可直接通過活體成像系統(tǒng)、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行檢測，觀察極其直觀方便7。此外，它還具有穩(wěn)定性好、耐受性強(qiáng)、對組織或細(xì)胞無毒性、易于構(gòu)建載體等優(yōu)點(diǎn)。因此，GFP在腫瘤的生長、藥效評價(jià)和基因治療等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。但是，由于GFP的發(fā)射波長較短因而穿透力稍差，在腫瘤應(yīng)用研究的某些方面仍然存在一定局限性。如YANG等8認(rèn)為熒光的強(qiáng)弱與腫

21、瘤大小、深度有關(guān)，淺表部位可以檢測到的最小病灶為59m；而深部腫瘤由于受到周圍組織的干擾，小的病灶常難以顯示。Caceres等9也證實(shí)GFP標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞適合于對淺表部位的腫瘤進(jìn)行成像研究，而熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞適合于對深部組織的原發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行研究?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)是分子生物學(xué)的常用技術(shù)之一，轉(zhuǎn)染所用載體主要包括病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒等）和非病毒載體（脂質(zhì)體、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣共沉淀、電穿孔等）。慢病毒( lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬,具有能夠轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細(xì)胞、目的基因整合入靶細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)治療基因,無明顯免疫反應(yīng)等特性,同時(shí)能夠轉(zhuǎn)染廣泛的組織、能夠被濃縮成高

22、滴度等優(yōu)點(diǎn)10。脂質(zhì)體載體最主要的優(yōu)點(diǎn)是介導(dǎo)的目的基因大小不受限制、無生物源性和毒性，更安全可靠。但是它的轉(zhuǎn)染效率較低，轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)缺少G418的選擇壓力作用下只能短暫表達(dá)，隨著新的腫瘤細(xì)胞的不斷復(fù)制分離，表達(dá)的熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸衰退。本實(shí)驗(yàn)以來源于人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的慢病毒為載體，成功建立了能夠在體外和體內(nèi)都能穩(wěn)定、長期、高效表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H460-GFP細(xì)胞，為活體熒光成像系統(tǒng)的進(jìn)一步應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有極高的靈敏度，對疾病動(dòng)物模型微小病灶的檢測靈敏度極高；該技術(shù)能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察，從而對同一實(shí)驗(yàn)對象

23、進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間差異，與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法相比，可以大大減少動(dòng)物的用量，符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則。本實(shí)驗(yàn)在成功建立表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌細(xì)胞系NCI-H460-GFP的基礎(chǔ)上，使用活體成像系統(tǒng)對不同濃度的細(xì)胞進(jìn)行了體外熒光表達(dá)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100個(gè)細(xì)胞就可以檢測到，說明成像系統(tǒng)具有較高的檢測靈敏度。通過連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察NCI-H460-GFP在裸小鼠體內(nèi)的生長情況，發(fā)現(xiàn)成像系統(tǒng)在腫瘤皮下移植7天時(shí)就可以檢測到熒光的表達(dá)，此時(shí)按傳統(tǒng)方法尚無法測量移植瘤體積。隨著移植瘤體積的不斷增加，成像系統(tǒng)可以通過平均量子數(shù)客觀地描述腫瘤的生長，所得數(shù)據(jù)與游標(biāo)卡尺測量的腫瘤體積相對應(yīng)

24、。至5周時(shí)瘤體表面出現(xiàn)壞死以后，盡管游標(biāo)卡尺測量的腫瘤體積仍在增加，但成像系統(tǒng)所測的熒光量子數(shù)反而呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是GFP屬于報(bào)告基因只能在活細(xì)胞中才能表達(dá)?；铙w成像系統(tǒng)能夠更加準(zhǔn)確地反應(yīng)腫瘤生長的實(shí)際情況，有利于減小人為實(shí)驗(yàn)誤差，所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀可靠。同時(shí)，應(yīng)用該系統(tǒng)也可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量大為減少，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，而且是以自身為對照動(dòng)態(tài)追蹤腫瘤的生長變化，有效的排除了動(dòng)物個(gè)體間差異的影響。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功建立了人肺癌NCI-H460-GFP細(xì)胞系，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測證實(shí)該細(xì)胞具有在體外和動(dòng)物體內(nèi)均能穩(wěn)定、持續(xù)、高效的表達(dá)綠色熒光蛋白的特點(diǎn)。另外，活體成像

25、系統(tǒng)具有較高的靈敏性，能夠客觀評價(jià)NCI-H460-GFP細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的生長情況，為成像系統(tǒng)的在肺癌的發(fā)展機(jī)理、藥物治療、基因治療等方面研究提供重要的參考依據(jù)。 致謝：真誠感謝“國家癌基因及相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”李宗海副研究員對本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。參考文獻(xiàn)：1 ANDY J. MINN,GAORAV P. GUPTA,PETER M.SIEGEL, et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lungJ.Nature,2005,436:518-524.2EBEN L.ROSENTHAL,BRIAN D.KULLBERSH,TER

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