液相常見問題

1、液相的常見問題：1、 在實(shí)際工作中，我們經(jīng)常能遇到基線的漂移的情況。關(guān)于基線漂移（或上下波動(dòng)）的原因，可能有以下幾種：1、柱子的平衡時(shí)間長(zhǎng)。一般來說，新柱子的平衡時(shí)間要短。有些老柱子的平衡是時(shí)間長(zhǎng)。當(dāng)然，柱子的平衡是時(shí)間也和它使用的流動(dòng)相有關(guān)系。如果使用了離子對(duì)試劑，那么比普通的簡(jiǎn)單的流動(dòng)相（例如 二元流動(dòng)相：甲醇：水，乙腈：水，）2、系統(tǒng)存在漏點(diǎn)。如果系統(tǒng)存在漏點(diǎn)，那么出現(xiàn)基線向下漂移。需要檢漏3、PUMP頭有氣泡。PUMP頭的氣泡會(huì)導(dǎo)致基線的漂移和波動(dòng)。如果懷疑是PUPM頭有氣泡導(dǎo)致基線不穩(wěn)，只需要看儀器的壓力是否穩(wěn)定就好。4、流動(dòng)相脫氣。如果流動(dòng)相沒有脫氣，基線肯定是不穩(wěn)的5、柱后氣泡。

2、在柱子后有氣泡產(chǎn)生，導(dǎo)致檢測(cè)器中的讀數(shù)有波動(dòng)。6、PUMP密封不好。密封不好，也會(huì)導(dǎo)致PUMP頭的氣泡（好象不可能）和漏夜，基線當(dāng)然不穩(wěn)定了。7、系統(tǒng)的環(huán)境。儀器的使用，如溫度的變化，流速的變化，以及梯度洗脫，當(dāng)然基線漂移8、單向閥睹塞或污染。單向閥的睹塞和污染，能造成流量不準(zhǔn)確，壓力 波動(dòng)。故也會(huì)波動(dòng)，漂移9、檢測(cè)器污染或有雜質(zhì) 10、 如果是紫外或二極管陣列檢測(cè)器（PDA），排除以上原因還出現(xiàn)基線噪音大，就有可能是氘燈的能量不足了二、主峰后面有很多雜質(zhì)峰可能原因1，儀器問題：最有可能的就是系統(tǒng)污染，尤其是管路，比如，入口單向閥或各接口處等有鹽殘留；2，色譜柱問題：這個(gè)好辦，換新的色譜柱，大

3、部分能解決問題；3，試劑試藥問題：所用試劑、試藥達(dá)不到色譜級(jí)別所需，或者不同批號(hào)不同廠家的東西都有可能影響，最直接影響的就是物質(zhì)的純度影響流動(dòng)相的吸收；4，梯度洗脫程序：梯度洗脫程序設(shè)置不合理，比如在某個(gè)時(shí)間段急劇變化；5，其他：如配制方法不同，超聲方法不同等。如今，看似很簡(jiǎn)單的問題，在經(jīng)過很長(zhǎng)一段時(shí)間的摸索后發(fā)現(xiàn)，上述原因其實(shí)都是比較客觀的，如果以上4點(diǎn)都解決不了，可以考慮以下原因：儀器本身功能上的區(qū)別導(dǎo)致。比如安捷倫低壓梯度和高壓梯度做的同樣的東西，能重復(fù)出來，而且梯度峰都很小，甚至沒有，而用島津的低壓和高壓梯度儀器，所表現(xiàn)的就不一樣了，具體原因，因只具有經(jīng)驗(yàn)所得，所以目前只能作為討論的一

4、個(gè)話題，僅供各位參考。 三、沖洗液相管路1、如果系統(tǒng)污染可以考慮用異丙醇沖洗，把過濾后的異丙醇當(dāng)流動(dòng)相，以0.5ml/min沖洗30-60分鐘，一般雜質(zhì)就可清除。如果不行可以考慮12%的磷酸沖洗，它可以有效清洗不銹鋼和其它材料的管路，清除有機(jī)雜質(zhì)及污垢，比用有機(jī)溶劑更有效，也比用稀硝酸有效（用5-15%硝酸清洗雖然有效，但是清洗后系統(tǒng)很難平衡，特別低紫外區(qū)域）。磷酸清洗方法如下：先用甲醇或者乙腈徹底清洗系統(tǒng)，然后是純水，然后是12%磷酸沖洗60分鐘左右，沖洗過程中可以將進(jìn)樣器一并沖洗，然后換用水，甲醇或乙腈沖洗，這樣就基本可以了。 2、用5%硝酸洗脫管路1h后未知峰去無蹤，效果不錯(cuò)，推薦大家有

5、必要試試如果不是污染嚴(yán)重，還是別用硝酸洗脫管路，因硝酸對(duì)不銹鋼管路損害較大4、 梯度洗脫做梯度洗脫有時(shí)候是會(huì)這個(gè)樣子的，基線會(huì)漂移的滿厲害的。要用足夠的時(shí)間來平衡，如果有在線脫氣裝置會(huì)好一點(diǎn)。特別是走梯度洗脫時(shí)后面往往有一些雜峰而有機(jī)相在不同的比例下吸光度也不一樣，由于UV檢測(cè)的是相對(duì)吸收度，所以就造成了基線漂移。而且，如果柱子沒有平衡好，這種漂移也不一樣。如果走上兩個(gè)小時(shí)后，這種漂移相對(duì)就穩(wěn)定。在梯度分析時(shí)，流動(dòng)相的選擇和波長(zhǎng)的選擇是很重要的；在梯度洗脫時(shí)，一般波長(zhǎng)不應(yīng)再變，否則再高的水平也做不好，尤其在低波長(zhǎng)時(shí)。 分析波長(zhǎng)較高時(shí)，流動(dòng)相相對(duì)容易些，如在300nm以上，影響相對(duì)較小。但是，在

6、大多數(shù)的情況下，流動(dòng)相首選低紫外吸收的，如乙腈和水，少用甲醇和四氫呋喃，無機(jī)鹽以磷酸鹽等低紫外吸收的為好，少用醋酸鹽、檸檬酸等有機(jī)鹽，酸用磷酸和硫酸少用醋酸，同時(shí)梯度變化盡可能小和緩和，雖然分析時(shí)間將增加。另外，A，B（C）相都采用混合流動(dòng)相，以減少流動(dòng)相變化對(duì)紫外的影響。還有一點(diǎn)，所用的試劑要求為色譜純，國內(nèi)有的廠家所標(biāo)的色譜純連化學(xué)純的都不如，有一些特定的添加試劑，如離子對(duì)試劑，只能使用進(jìn)口的色譜純級(jí)。注意以上幾點(diǎn)，你的梯度色譜圖必將大有改觀。當(dāng)然你的儀器也要好的了。 建議您使用一種方法：扣除本底法。此種方法由色譜工作站來完成，具體方法是：1、不進(jìn)樣，嚴(yán)格按梯度方法空跑出基線，得出不進(jìn)樣的

7、梯度基線。2、進(jìn)樣，做梯度洗脫，得到譜圖。3、在工作站上用譜圖相減的功能處理，用譜圖減去梯度基線，即可得到比較漂亮的譜圖，而且不影響定量計(jì)算！五、樣品池污染1、如果是流通池臟，可以把柱子去下來，用5050（v/V)的異丙醇、異丙醇純水、來沖洗流通池。如果還不行，用1N的硝酸沖流通池，再用純水沖洗。 2、液相管路臟、樣品池臟、樣品池能量比參比池低很多，處理方法：不接柱子，接上二通管，用8%硝酸沖洗2小時(shí)，純水沖洗2小時(shí)，用甲醇過度，接著用異丙醇沖洗2小時(shí)，最后過度成甲醇。結(jié)果：基線平穩(wěn)，峰行明顯改善，樣品池能量恢復(fù)六、異丙醇的作用：在安捷倫液相中會(huì)使用的10異丙醇，它的作用是柱塞清洗附件的清洗液

8、，它主要是當(dāng)流動(dòng)相中含有鹽類時(shí)，為了防止鹽類在柱塞產(chǎn)生結(jié)晶，磨損寶石桿和柱塞密封圈，加入異丙醇10異丙醇一方面有防止長(zhǎng)菌的作用，另一方面有增加清洗液的潤濕性，減少泵內(nèi)氣泡產(chǎn)生。在泵運(yùn)行的時(shí)候一定不能干。異丙醇是一個(gè)很特殊的角色，是維護(hù)液相的專業(yè)溶劑，它的“露面”至少有以下幾處：1、10%的異丙醇是柱塞清洗附件的清洗液。2、更換密封圈后用異丙醇磨合。3、洗針用溶劑。4、峰拖尾時(shí)，可嘗試用異丙醇沖柱子。5、泵的壓縮性補(bǔ)償值，是以異丙醇為基準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)的100，而常用的流動(dòng)相：甲醇120，乙腈115，而水則偏差較大，是46。6、正相和反相系統(tǒng)轉(zhuǎn)換時(shí)的中間過度溶劑。另外在其他廠家的液相中使用30甲醇，作用

9、都是和異丙醇的一樣，用于洗泵和洗針。七、檢測(cè)限與定量限S/N=3時(shí)的濃度是檢測(cè)限，也就是峰高約在基線噪音高的3倍，注入液相色譜儀的對(duì)照品百分濃度。S/N=10是定量限，也就是峰高約在基線噪音高的10倍時(shí)，注入液相色譜儀的對(duì)照品量。首先，配制一個(gè)較低濃度的對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，觀察其峰高比基線噪音高多少倍（假設(shè)X倍），將該溶液稀釋到X/3倍，基本即為該物質(zhì)的檢測(cè)限，將該溶液稀釋到X/10倍，基本即為該物質(zhì)的定量限。在新的“指導(dǎo)原則”中提到了檢測(cè)限和定量限，以檢測(cè)限為例：“檢測(cè)限系指試樣中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。”“無論用何種方法，均應(yīng)用一定數(shù)量的樣品，其濃度為近

10、于或等于檢測(cè)限，進(jìn)行分析，以可靠地測(cè)定檢測(cè)限。”其中第一句中指出是最低量，但第二句中又類比為濃度，所以，可以看出，官方對(duì)這個(gè)概念的定義也不是很嚴(yán)格。另外，在報(bào)新藥時(shí)，可同時(shí)寫入申報(bào)資料，如標(biāo)題是：檢測(cè)限的測(cè)定；結(jié)果中寫：最低檢測(cè)量是xx ng，最低檢測(cè)濃度是xx ug/ml。這樣就不會(huì)因?yàn)楦拍畛鰡栴}了。（我們就是這樣做的）而最低檢測(cè)量就是最低檢測(cè)濃度乘以進(jìn)樣量，寫明任一個(gè)結(jié)果均可。不會(huì)被認(rèn)為是錯(cuò)誤的。個(gè)人認(rèn)為，審評(píng)人員看中的是你對(duì)問題的解決途徑，就是說問題是否被很好解決了，對(duì)于結(jié)果的撰寫形式，倒是很少那么較真吧。因?yàn)樗砸岩膊荒軠?zhǔn)確地定義，呵呵。我個(gè)人認(rèn)為噪音峰不應(yīng)該計(jì)最大的，而應(yīng)該以出現(xiàn)頻率

11、最多的信號(hào)計(jì)，如果以最大的噪音峰來計(jì)，檢測(cè)限會(huì)偏 大的。我平時(shí)做檢測(cè)限的時(shí)候通常是在做有關(guān)物質(zhì)自身對(duì)照溶液線性的時(shí)候，選取濃度最低的樣品稀釋進(jìn)樣，我的經(jīng)驗(yàn)是：這樣做稀釋的次數(shù)要少，且好計(jì)算。如果沒有目的地一針一針的試，通常到最后就已經(jīng)沒有濃度的概念了。記得，我剛?cè)胄械臅r(shí)候，跟著老師做，檢測(cè)限，她只告訴我做到S/N=3。然后，我就這么茫目的稀釋，光那個(gè)檢測(cè)限，我就做了大半天?，F(xiàn)在想起來都覺得糗。檢測(cè)限(limit of detection，LOD)當(dāng)用儀器分析方法時(shí)，可用已知濃度的樣品與空白試驗(yàn)對(duì)照，記錄測(cè)得的被測(cè)藥物信號(hào)強(qiáng)度S與噪音(或背景信號(hào))強(qiáng)度N，以能達(dá)到SN2或SN3時(shí)的樣品最低藥濃為

12、LOD；也可通過多次空白試驗(yàn)，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差(即3空或3S空)作為檢測(cè)限的估計(jì)值。定量限 (limit of quantitation，LOQ)將多次空白試驗(yàn)測(cè)得的背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(即空白標(biāo)準(zhǔn)差)乘以10，作為定量限的估計(jì)值，繼之，再通過分析適當(dāng)數(shù)量已知接近定量限或以定量限制備的樣品來驗(yàn)證。八、PPM簡(jiǎn)單的說：1ppm=1mg/kg=1mg/L=1×10-6 常用來表示氣體濃度，或者溶液濃度。 ppm是英文parts permillion的縮寫，譯意是每百萬分中的一部分，即表示百萬分之（幾），或稱百萬分率。如1ppm即一百萬千克的溶液中含有1千克溶質(zhì)。ppm

13、與百分率（）所表示的內(nèi)容一樣，只是它的比例數(shù)比百分率大而已。 在花卉生產(chǎn)栽培中，常常施用“微肥”和“植物激素”，這些藥劑在施用時(shí)，其用量甚微，每千升的容量中只含有幾毫克甚至更少，故用“ppm”來表示。九、紫外掃描定檢測(cè)波長(zhǎng)方法一:波長(zhǎng)掃描，找最大吸收不就行了，一般是掃描，取最大波長(zhǎng)。辦法二:如果測(cè)有關(guān)物質(zhì)，一般選擇254。如果測(cè)含量，一般選擇最大吸收波長(zhǎng)。方法三:一般的液相上具有二極管陣列檢測(cè)器的,都可以進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,以取得最大吸收峰,如果沒有這種功能的,可以從254開始,每格5或10的波長(zhǎng)進(jìn)行增加尋找,可以比較麻煩,也是沒辦法的辦法.當(dāng)然了,最好要有純物質(zhì),這樣比較準(zhǔn)確點(diǎn).方法選擇問題:比如

14、,流動(dòng)相配制流速取樣量波長(zhǎng)溶劑選擇,以及檢測(cè)器的選擇等,都是要考慮的問題.如果沒有那種功能，可以用紫外掃描儀掃描，這樣就可以找到最大吸收波做波長(zhǎng)掃描是最簡(jiǎn)單的方法,如果不成,可以判斷樣品中的特定官能團(tuán),查相關(guān)文獻(xiàn),會(huì)有對(duì)此官能團(tuán)的最大吸收波長(zhǎng),以其做參考,在其波長(zhǎng)附近.做幾個(gè)相差5或10nm的.一般不論實(shí)驗(yàn)是測(cè)含量還是有關(guān)物質(zhì),波長(zhǎng)選擇都先用流動(dòng)相配制樣品掃一張紫外圖譜,初步確定最大吸收波長(zhǎng),以作參考.而真正選擇哪個(gè)作為檢測(cè)波長(zhǎng)還需在液相上試.因?yàn)橥c紫外掃描有差異.影響因素很多,樣品的濃度差異,液相上流動(dòng)相有時(shí)是雙泵混合而得與手動(dòng)配制也有一定的差異.含量測(cè)定一般選用液相上待測(cè)成分吸收最大的波長(zhǎng),因?yàn)榇藭r(shí)靈敏度最大,誤差相對(duì)小.但若1.其最大吸收波長(zhǎng)是比較靠近200nm,由于溶劑截止波長(zhǎng)的影響當(dāng)然也可適當(dāng)將波長(zhǎng)往長(zhǎng)波方向移;2.有時(shí)需同時(shí)測(cè)定多種成分,且最大吸收波長(zhǎng)差異又較大,為兼顧也可選擇中間波長(zhǎng).有關(guān)物質(zhì)的波長(zhǎng)選擇因是檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)且常常量小,一般是選用有關(guān)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng).同樣也存在為方便同時(shí)檢測(cè)多個(gè)有關(guān)物質(zhì)而選用中間波長(zhǎng)的情況.有關(guān)物質(zhì)的情況比較復(fù)雜,在未知有關(guān)物質(zhì)數(shù)目種類的條件下最好能用二極管陣列檢測(cè)器,以防止在某