食品中組胺的測定.總結(jié)

1、組胺的檢測組胺是自體活性物質(zhì)之一，在體內(nèi)由組氨酸脫羧基而成，組織中的組胺是以無活性的結(jié)合型存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞的顆粒中，以皮膚、支氣管粘膜、腸粘膜和神經(jīng)系統(tǒng)中含量較多。當機體受到理化刺激或發(fā)生過敏反應(yīng)時，可引起這些細胞脫顆粒，導(dǎo)致組胺釋放，與組胺受體結(jié)合而產(chǎn)生生物效應(yīng)?？菇M胺是拮抗組胺對人體的生物效應(yīng)，即應(yīng)用抗組胺藥物?？菇M胺受體就是拮抗組胺的 H1 和 H2 受體。由于此兩種受體在人體內(nèi)分布不同而產(chǎn)生不同的效應(yīng)，它是抗組胺藥應(yīng)用治療疾病的生理藥理基礎(chǔ)。毒理藥物中毒 組胺主要用于胃分泌功能檢查，作最大酸分泌 (MAO)測定。但目前已被五肽胃泌素 取代。組胺通過激活體內(nèi)組胺 H1受體和

2、H2受體，收縮多種平滑肌如氣管、支氣管和胃腸道平滑?。坏瑫r松弛小血管平滑肌，增加毛細血管通透性；還能強烈刺激胃酸分泌，減慢房室傳導(dǎo)，增加心肌收縮力等。誤用大劑量或靜脈給藥可引起中毒。食物中毒大量檢測表明，海產(chǎn)魚中的青皮紅肉魚類含組胺較高，當魚不新鮮或腐敗時，魚體中游離的組胺酸經(jīng)脫羧酶 作用產(chǎn)生組胺 .組胺中毒 潛伏期一般為 0.51 小時，最短可為5min, 最長達 4h.檢測方法1分光光度法1 主要儀器和試劑721型分光光度計組胺標準溶液：取經(jīng) 95干燥 25小時的磷酸組織胺分析純試劑配制成含 20ug·ml 的組胺標準溶液。 0 2 對氨基苯磺酸溶液 ( 簡稱甲液 )1oNNa

3、NO溶液( 簡禰乙液 ) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。所用水均為二次蒸餾水。2 組胺測定方法及條件試驗21 測定方法：在 25ml容量瓶中，移入一定量的組胺標準溶液，依次加入0-2甲液、 04%HCI、10%乙液和 2 0%NaCO溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。于25室溫下放置 20分鐘，用試劑空白為參比，測其吸光度值。22 吸收光譜：取 20ml組胺標準溶液，按上述方法顯色，以水為參比，分別測定顯色化合物和試劑空白的吸收光譜。圖 1表明顯色化合物在 506nm 處有一最大吸收，本實驗取 506nm 作為吸收波長。23 顯色條件試驗231 Na CO 用量對顯色反應(yīng)的影響：試驗結(jié)果如圖2(a) 所示：該顯色反應(yīng)

4、必須在堿性溶液中才能進行，此時在堿性介質(zhì)中組胺與重氮酸鹽起偶聯(lián)反應(yīng)。232 HC1用量對顯色反應(yīng)的影響：圖2(b) 表明隨著 HCI用量增加，進行重氯化反應(yīng)的程度也隨之加快當 HC1加入量在 0510ml之間，吸收達最大值。2高效液相色譜法1 材料與方法1 1 儀器與試劑美國 Biorad 700高效液相色譜儀， 1706 UV 紫外檢測器，分析天平，恒溫水浴箱，均質(zhì)機，離心機， 0 45m 針頭微孔濾膜過濾器等。組胺標準品由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，純度99%。氨水 ( 25%) 、碳酸氫鈉、高氯酸、氫氧化鈉、丹酰氯均為分析純，甲醇、丙酮和乙腈均為色譜純，實驗用水均為雙蒸水，并經(jīng) Mill

5、i Q 超純處理。溶液配制 :稱取一定量的組胺標準品，用0 4mol / L 高氯酸配制成濃度為1 mg / mL的組胺標準溶液，放于冰箱中 4 保存，一周一配。精確稱取適量丹磺酰氯，用丙酮溶解并配制成濃度為10 mg/mL 的溶液，經(jīng)過 0 45 m 針頭微孔濾膜過濾器過濾后，4 冰箱中保存，備用。1 2樣品采集與處理于廣州市某大型超市購買具有相近生產(chǎn)日期、不同品牌的大豆發(fā)酵醬油、豆醬各三種，盒裝及散裝豆豉各一種，酸奶六種，啤酒( 易拉罐裝 ) 五種。豆豉和豆醬分別取出適量，于研缽中搗碎、混勻，酸奶和醬油搖勻。準確稱取2 0g 豆豉或豆醬樣品 ( 酸奶 5 0 g ，醬油 2 0 mL)，置

6、于 15 mL 離心管中，加入 10 mL 0 4 mol / L高氯酸，用均質(zhì)機搗碎、混勻，在3000 r / min的條件下離心 10 min; 取出上層清液，再次加入 10 mL 0 4 mol/L 高氯酸，充分混勻，在 3000 r / min 的條件下離心 10 min; 取出上層清液，合并兩次清液并過濾，用 0 4 mol/L 的高氯酸定容到 25 mL。取啤酒樣品 20 mL 于小燒杯，室溫超聲脫氣 20 min 。準確量取 5 mL 于 15 mL 離心管中，加入 2 5 g 氯化鈉，振蕩使之溶解并達到飽和，再加入 3 mL 正丁醇 氯仿 ( 體積比 50 50) 溶液，加蓋旋

7、緊，充分振蕩 10 min ，于 3000 r/min 條件下離心 10 min ，取上層清液 2 mL 于離心管中，于 40 水浴條件下氮氣吹干后，再加入0 1 mol/L鹽酸 0 5 mL 。1 3柱前衍生取樣品提取液 0 25 mL ，加入 25 L 2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值，加入 75L 飽和碳酸氫鈉溶液和 0 5 mL 10 mg/mL 丹酰氯 丙酮溶液，搖勻，于40 水浴下避光反應(yīng) 45 min;反應(yīng)畢，取出加入 25 L 25% 的濃氨水，靜置 30 min ，用乙腈定容至 1 25 mL ，振蕩混勻。將衍生后溶液用0 45m 針頭微孔濾膜過濾器過濾，用高效液相色譜測

8、定。1 4色譜條件 Biorad 700 高效液相色譜系統(tǒng)，配 1706 UV 紫外檢測器。檢測條件 : Hypersil C18色譜柱 ( 250 ×4 6 mm I D ，粒徑 5 m) ，柱溫為室溫 ;流動相 V( 乙腈 ) V(水) = 60 40; 流速 1 0 mL/min; 紫外檢測波長254 nm; 進樣量 20L;采樣時間 30 min; 以峰面積為定量指標。3酶聯(lián)免疫吸附試驗法1儀器設(shè)備、試劑和方法11 儀器設(shè)備450nm 波長微量酶標儀 , 均質(zhì)器 ,離心機 , 微量加樣器 , 微量多通道加樣器 , 紫外分光光度計。12 試劑正戊醇 ,三氯乙酸溶液 ( 100g

9、 /L ),碳酸鈉溶液 ( 50g /L),氫氧化鈉溶液( 250g /L ), 鹽酸 ( 1+ 11) 。試劑均為優(yōu)級純 , 所用水為蒸餾水。酶聯(lián)免疫吸附分析定量檢測組胺殘留試劑盒為德國 R-B iopharm 公司制造。13 檢測方法131 紫外分光光度法 (GB /T 5009145-2003) 4 魚體中組胺用正戊醇提取遇偶氮試劑顯橙色 , 與標準系列比較定量 , 檢測限為 50mg /kg 。,132 EL ISA法樣品處理 :取3g均質(zhì)物于 27mL 蒸餾水混合后 ,取 1mL懸浮液放入離心管中 ,在室溫 ( 20e 25e )離心 5m in( 2500g) ,吸除脂肪層 ,10

10、mL 蒸餾水稀釋。?；?:所有標準 ( 0Lg /L、015Lg /L取20LL的上清液用、 115Lg /L 、5Lg /L、15Lg /L和50Lg /L) 溶液、質(zhì)控及樣品都做平行樣,記錄好標準、質(zhì)控和樣品的位置 ,分別向酰化板孔中加入 100LL的標準溶液、質(zhì)控及樣品,加入 25LL的?；噭┑礁魑⒖字?, 加入 200LL的?；彌_液到各微孔中,輕輕搖動并混合均勻 ,室溫 ( 20e 25e )孵育 15m in 。EL ISA 測定 : 將足夠標準溶液、質(zhì)控和樣品所用數(shù)量的微孔板插入微孔架, 標準溶液、質(zhì)控和樣品做 2個平行實驗 ,標記各自位置 , 加入 25LL ?；臉藴嗜芤?、

11、質(zhì)控和樣品液到各自的微孔中 ,加入 100LL組胺抗體到每一個微孔底中充分混合 , 在室溫 ( 20e 25e )孵育 40m in, 倒出孔中的液體 ,將微孔板架倒置在吸水紙上拍打 ( 每輪拍打 3次) 以確保完全除去孔中的液體, 將 250LL洗滌緩沖液加入孔中 , 再次倒掉微孔中的液體 , 重復(fù) 2次上述的操作 ,加入 100LL 酶標記物到每一微孔中 , 充分混合并在室溫孵育 20m in, 洗板 , 重復(fù)上述的洗板操作步驟 , 加入 100LL 底物 / 發(fā)色劑到每 - 微孔中 , 充分混合后在室溫暗處孵育 15m in, 加入 100LL 反應(yīng)終止液到每一微孔中 , 充分混合后在波

12、長 450nm 處測定吸光度值 , 以空氣為空白 , 必須在加入反應(yīng)終止液后 10m in 內(nèi)讀取吸光度值。結(jié)果計算 :所獲得的標準、質(zhì)控和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準溶液( 零標準 ) 的吸光度值再乘以 100%, 因此零標準溶液的吸光度值等于100%, 吸光度值以百分比表示。吸光度值=標準溶液的吸光度值 ( 質(zhì)控或樣品溶液的吸光度值 ) 零標準溶液的吸光度值 *100% 4電化學(xué)檢測組胺實驗方法衍生化反應(yīng)在室溫下進行。取待測溶液 50 LL 加入 10 LL 衍生化試劑 ,超聲反應(yīng) 1 min 后置于冰水中終止反應(yīng)。碳圓盤電極的制備 : 取干凈滴管 ,以300 Lm石墨做電極芯 ,

13、銅絲銅棒做引線。電極芯用膠水固定在滴管細端中心,約0. 5cm 伸出玻璃管外 ,懸掛固化 24 h 。電極芯的另一端用銅絲引出,并用銅棒固定在滴管的另一端。毛細管使用前用 0. 1 mo l/ L NaOH 、二次水、緩沖液分別沖洗 5、 2、 10 min 。電極使用前用細砂紙打磨 , 并超聲波清洗 , 以三維定位調(diào)節(jié)器使工作電極與毛細管出口在同一直線上 , 在毛細管末端 , 以 50 mmol/ L 硼砂- 硼酸緩沖液為運行液 , 采用電動進樣。溶液使用前均用 0. 22 Lm 濾膜過濾。毛細管電泳 - 電化學(xué)發(fā)光法實驗方法實驗前將毛細管依次用 1 mol/L HCl ， 超純水， 0.1

14、 mol/L NaOH沖洗 20 min ，然后用運行磷酸鹽緩沖溶液平衡812 h 。檢測池中采用三電極體系，工作電極為 Pt 盤電極， 參比電極為 Ag/AgCl 電極，對電極為 Pt 絲電極，在顯微鏡下將毛細管出口與工作電極對齊， 調(diào)節(jié)兩者距離約 100 m。檢測池中添加 250 L Ru（bpy）32+和 50 mmol/L 磷酸鹽混合液。為了獲得良好的重現(xiàn)性，減小由于溶劑蒸發(fā)等因素的影響，每2 h更換 1 Ru（bpy）32+。光電倍增管高壓設(shè)為 800 V ，將毛細管進樣管端插入緩沖液中，待發(fā)光信號基線穩(wěn)定后進樣檢測。樣品前處理：稱取 5 g已均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入 10 mL 6% HClO41518 均質(zhì) 1 min ， 4 000 r/min下離心10 min ， 取上清液于 50 mL 容量瓶中，殘渣中加入 10 mL 6% HClO4重復(fù)萃取 1次， 合并 2 次上清液，用6% HClO4定容至 50mL。若有必要，可用 6% HClO4進行稀釋，以確保所得濃度在線性范圍內(nèi)。使用前再用0.22m 的醋酸纖維濾膜過濾。書是我們時代的生命 別林斯基書籍是巨大的力量 列寧書是人類進步的階梯 高爾基書籍是人類知識的總統(tǒng) 莎士比亞書籍是人類思想