突破衍射極限的超高分辨率成像技術(shù)發(fā)展 (修改)

1、結(jié)課論文題 目突破衍射極限的超高分辨率成像的技術(shù)進展學(xué)生姓名學(xué) 號學(xué) 院專 業(yè)班 級二一五年十二月一 引言1.1 選題意義光學(xué)顯微成像具有極為悠久的歷史，但一直以來，光學(xué)成像一直受到衍射極限的限制而分辨率無法突破200 nm。后來雖然有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、x光衍射儀等微觀觀測或者顯像設(shè)備，但是使用光學(xué)顯微鏡可以在活體狀態(tài)下觀察生命體使得其在生物、醫(yī)學(xué)觀察方面仍有巨大優(yōu)勢。值得慶賀的是近年來，超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展使得光學(xué)顯微成像分辨率達到了20 nm以下。其中德國科學(xué)家Stefan Hell、美國科學(xué)家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率顯微技術(shù)方面

2、的突出貢獻獲得了2014年的諾貝爾化學(xué)獎。在這篇文章中，我們就簡要介紹一下超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，并對諸位大師致以敬意。1.2 技術(shù)指標(biāo)顯微技術(shù)成像優(yōu)劣一般通過X-Y平面分辨率與Z軸分辨率大小來判定，分辨率越高數(shù)值越小。下表是各種顯微成像技術(shù)的分辨率指標(biāo)。成像技術(shù)X-Y平面分辨率（nm）Z軸分辨率(nm)普通光學(xué)顯微鏡200-300500-7004Pi顯微鏡100-150STED顯微技術(shù)50-70STED+4技術(shù)5050PALM技術(shù)20303D STORM技術(shù)20-3050-60dSTORM技術(shù)30502D SSIM技術(shù)503D SSIM技術(shù)100200電子顯微鏡0.05X光衍射儀0.

3、03-10二 衍射極限2.1 衍射極限我們能看到什么？看到多小的范圍？看得有多清楚？幾百年來，依靠不斷進步的科學(xué)手段，微觀世界正一層層揭開面紗，讓人們可以看得越來越“小”，進而可以進行研究。人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物體，再小，就要借助工具。1665年，英國科學(xué)家羅伯特·虎克制造了第一臺用于科學(xué)研究的光學(xué)顯微鏡，用它觀察薄薄的軟木塞切片?；⒖丝吹搅藲埓娴闹参锛毎?，它們一個個像小房間一樣緊挨在一起，這就是“細胞”一詞的由來。 此后，顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，幫助科學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)了細菌和微生物。那么，光學(xué)顯微鏡是否可以無止境地“放大”下去，讓我們想看到多小就能看到多小？科

4、學(xué)家為此做了很多嘗試，最終發(fā)現(xiàn)，存在一道法逾越的“墻”衍射極限。 1873年，德國科學(xué)家阿貝提出了衍射極限理論：光是一種電磁波，由于存在衍射，一個被觀測的點經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)成像后，不可能得到理想的點，而是一個衍射像，每個物點就像一個彌散的斑，如果這兩個點靠得很近，彌散斑就疊加在一起，我們看到的就是一團模糊的圖像。 阿貝提出，分辨率的極限近似于入射光波長的二分之一(d=/2)?？梢姽獾牟ㄩL通常在380780納米之間，根據(jù)衍射極限公式，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限就在200納米（0.2微米）左右。如果物體小于0.2微米，你仍舊看到的是一個模糊的光斑。這就是很長一段時間內(nèi)，光學(xué)顯微鏡的分辨極限衍射極限。2.2

5、 突破衍射極限為了更深入的觀察世界，后來有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、x光衍射儀等微觀觀測或者顯像設(shè)備，人們借助它們可以看得更“細”。但是這些設(shè)備依然沒有突破衍射極限，他們依然遵循著阿貝衍射極限。這些設(shè)備使用的是電子束等波長非常短的入射光，自然，它們的分辨率就高。比如電子顯微鏡，分辨率可以達到0.5埃（一埃等于十分之一納米），這樣就可以看到一粒一粒的原子。由于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)方面的研究，更希望在生命體存活的自然狀態(tài)下進行觀察，在這方面，光學(xué)顯微鏡有它不可比擬的優(yōu)勢。因此，光學(xué)顯微鏡的研發(fā)還是世界科學(xué)家的研究熱點。突破性的進展發(fā)生在本世紀初，近年來，隨著新的熒光探針和成像理論的出現(xiàn)，研究者開發(fā)了多種

6、實現(xiàn)超出普通共聚焦顯微鏡分辨率的三維超分辨率成像方法。較成熟的有基于單分子成像的超分辨率顯微成像方法，包括光激活定位顯微技術(shù) (photoactivated localization microscopy, PALM) 和隨機光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù) (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。以及兩大類通過改造光源的點擴散函數(shù)來提高成像分辨率的方法，分別是受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(stimulated emission depletion, STED)和飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)。(參考文獻：呂志堅，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進

7、展) 以上這些進展,都讓光學(xué)顯微鏡突破了衍射極限，我們稱之為“超分辨成像技術(shù)”。美國光學(xué)學(xué)會把它列為21世紀光學(xué)五大研究計劃之首。三 超高分辨率顯微技術(shù)3.1光激活定位顯微技術(shù)PALM當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個或者更多點光源的時候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來進行精確定位而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個熒光分子的時候，通過特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達到納米級如上所述，盡管單分子的定位精度可以達到納米級，但它并不能提高光學(xué)顯微鏡在分辨兩個或者多 個 點 光 源 時 的 分 辨 率2002 年 ， Patterson 和Lippincott-Schwartz首次利用

8、一種綠色熒光蛋白(GFP)的變種(PA-GFP)來觀察特定蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的運動軌跡這種熒光蛋白 PA-GFP 在未激活之前不發(fā)光，用 405 nm 的激光激活一段時間后才可以觀察到 488 nm 激光激發(fā)出來的綠色熒光德國科學(xué)家 Eric Betzig 敏銳地認識到，應(yīng)用單分子熒光成像的定位精度，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來突破光學(xué)分辨率的極限2006 年 9 月， Betzig和 Lippincott-Schwartz 等首次在 Science 上提出了光激活定位顯微技術(shù)( photoactivated localization microscopy, PALM) 的 概 念 其 基

9、本 原 理 是 用PA-GFP 來標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié) 405 nm 激光器的能量，低能量照射細胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然后用 488 nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子在確定這些分子的位置后， 再長時間使用 488 nm激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來之后，分別用 405 nm 和 488 nm 激光來激活和漂白其他的熒光分子，進入下一次循環(huán)這個循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位將這些分子的圖像合成到一張圖上， 最后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高 10 倍以上分辨率的顯微技術(shù)，如

10、圖 1 所示。PALM 顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來說可以達到 1 nm 的數(shù)量級。2007 年， Betzig 的研究小組更進一步將PALM 技術(shù)應(yīng)用在記錄兩種蛋白質(zhì)的相對位置，并于次年開發(fā)出可應(yīng)用于活細胞上的PALM 成像技術(shù)來記錄細胞黏附蛋白的動力學(xué)過程。（參考文獻：Patterson G H, Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells；Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et

11、al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution；Shroff H, Galbraith C G, Galbraith J A, et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes）圖1：應(yīng)用PALM技術(shù)定位單個熒光分子最后實現(xiàn)超分辨率成像的示意圖A， B， C， D， E， F 展示了實際實驗過程及得到的原始數(shù)據(jù)； A，B， C， D

12、， E， F 展示了用高斯擬合確定熒光分子的中心，疊加產(chǎn)生了超分辨率圖像； (A, A) 未激活任何熒光分子時； (B, B) 用405 nm 的激光激活了 4 個熒光分子； (C, C) 用 488 nm 的激光觀察一段時間后漂白了第一輪激活的 4 個熒光分子； (D, D)第二輪重新激活的另外的幾個熒光分子； (E, E) 兩輪激活的熒光分子總和組成的圖像； (F, F) E 圖的局部放大3.2多色隨機光學(xué)重構(gòu)顯微法PALM 的成像方法只能用來觀察外源表達的蛋白質(zhì)，而對于分辨細胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力。但是利用化學(xué)小分子Cy3和Cy5、 Cy7等熒光分子對的光轉(zhuǎn)換效應(yīng)同樣可以達到突破光學(xué)

13、極限的效果。這項技術(shù)被稱為“隨機光學(xué)重建顯微術(shù)” (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。其發(fā)明人是哈佛大學(xué)的莊小威教授。這項技術(shù)是用很弱的光激發(fā)熒光分子，使細胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點分布比較分散，重疊比較少，因此每個光暈可以近似為一個熒光分子。在一次激發(fā)中，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發(fā)中，可以確定另外一部分光暈的中心，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加，就是完整而清晰的圖像（圖2）。因此， STORM需要利用熒光發(fā)色團標(biāo)記抗體對靶蛋白進行識別，可以檢測到內(nèi)源性蛋白，避免由于外源性表達偶聯(lián)熒光蛋

14、白的靶蛋白對其定位產(chǎn)生的可能的影響，但是在活細胞應(yīng)用中受到限制，并且也有可能受到免疫熒光染色過程的影響。隨后，他們又利用光學(xué)像散性實現(xiàn)了3D STORM，達到了平面2030 nm，縱向5060 nm的成像精度。（參考文獻：夏鵬，竇震.超高分辨率顯微技術(shù)研究進展；Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy）利用某些熒光小分子自身可被反復(fù)激發(fā)淬滅的性質(zhì)，通過與STORM相似的操作方法，可以實現(xiàn)單一熒

15、光分子的超高分辨率成像，這一方法大大簡化了原始STORM的樣品制備過程，被稱為dSTORM(direct STORM)。值得一提的是，莊小威研究組將SNAP標(biāo)簽與靶蛋白融合表達，同時將熒光分子偶聯(lián)到可以結(jié)合SNAP標(biāo)簽的小分子化合物上，進而標(biāo)記靶蛋白，再通過降低溶解氧消耗系統(tǒng)以及脂肪族巰醇的添加量，成功地在三維超高分辨率的成像中實現(xiàn)了空間分辨率平面30 nm，軸向50 nm，時間分辨率12 s的優(yōu)異效果。有意思的是幾種細胞膜標(biāo)記物也被鑒定出具有光轉(zhuǎn)換性質(zhì)，并被用于超高分辨率顯微成像，在活細胞中得到了3060 nm的空間分辨率和12 s的時間分辨率。最近，基于ImageJ的PALM/STORM數(shù)

16、據(jù)處理插件已經(jīng)發(fā)布，為這兩種關(guān)鍵技術(shù)的應(yīng)用提供了極大便利。（參考文獻：Heilemann M, van de Linde S, Schuttpelz M, et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes；楊光.隨機光學(xué)重建顯微中的光學(xué)設(shè)計與數(shù)據(jù)處理）但是， STORM 方法也存在缺陷，由于用抗體來標(biāo)記內(nèi)源蛋白并非一對一的關(guān)系，所以STORM 不能量化胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的數(shù)量，同時也不能用于活細胞測量。（參考文獻：毛錚樂，王琛.超分辨遠場生物熒光成像-突破光學(xué)衍射極限

17、）圖2：隨機光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)效果圖3.3 STED受激發(fā)射損耗顯微術(shù)在1994年， Stefan提出了一種理論，利用受激輻射損耗原理，將一束由相位調(diào)制產(chǎn)生的空心環(huán)形激光圍繞激發(fā)光，導(dǎo)致環(huán)形區(qū)域內(nèi)的分子受激輻射，而只有光束中心部分的熒光分子被激發(fā)光照射產(chǎn)生自發(fā)輻射，進而被獨立檢測出來。隨著環(huán)形激光強度不斷升高，其孔徑也相繼減小，藉此突破光學(xué)極限(圖3)。他們將這種顯微鏡技術(shù)命名為STED(stimulated emission depletion microscopy)。幾年后他在哥廷根大學(xué)制造出了這種顯微鏡，將xy軸分辨率水平從200 nm提升到了70 nm左右(圖3)，成功地打破了光學(xué)分辨率

18、極限。隨后， Hell領(lǐng)導(dǎo)的研究組又通過將STED與4Pi結(jié)合以及通過兩種相位調(diào)制的方法，將其從二維成像擴展到三維(3D STED)，實現(xiàn)了xyz三個方向上的超高分辨率成像。由于STED技術(shù)以共聚焦顯微鏡為基礎(chǔ)，因而在成像深度上具有很大的優(yōu)勢，實驗證實其可以在350m厚度的腦切片中得到極高的分辨率。目前應(yīng)用STED技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了在活體小鼠中直接對腦組織進行觀察，其觀察深度達1015m ，分辨率至少達到70 nm。（參考文獻：夏鵬，竇震.超高分辨率顯微技術(shù)研究進展）應(yīng)用 STED 成像，點光源的光斑大小直接發(fā)生 改 變 ， 其 半 高 寬 大 小 從 傳 統(tǒng) 的 2nsin 變 成2nsin1+

19、IIsat，其中 I 是 STED 激光器的最大聚焦強度，而 Isat 則是當(dāng)受激熒光強度被減少到 1/e時的 STED 激光的強度特征值由此公式可看出，當(dāng) I/Isat 的值趨近無窮大時， STED 成像的點光源的半高寬趨近于 0，亦即分辨率不再受光的衍射過程所限制STED 成像技術(shù)的最大優(yōu)點是可以快速地觀察活細胞內(nèi)實時變化的過程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛例如，應(yīng)用成熟的 STED 顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元上囊泡蛋白 synatotagmin在各種刺激后都以一種“簇”的形式存在于神經(jīng)突觸前端膜上，這首次揭示了這種膜蛋白以集合的形式存在于細胞質(zhì)膜上然后被統(tǒng)一回收的方式。之后 Hell等

20、又進一步發(fā)展了這種方法，使之可以用于 EGFP標(biāo)記的信號和多種顏色的超分辨率檢測目前， STED 作為一種成熟的方法，已經(jīng)可以高速地監(jiān)測活細胞內(nèi)高分辨率圖像。例如在2008年Science上發(fā)表的文章表明，應(yīng)用STED技術(shù)已經(jīng)可以以視頻的速度(每秒 28 幀)來采集記錄神經(jīng)細胞內(nèi)突觸小泡的高分辨率圖像(50 nm)。（參考文獻：呂志堅，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進展；Willig K I, Kellner R R, Medda R, et al. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy；Meyer L, Wildanger D

21、, Medda R, et al. Dual-color STED microscopy at 30-nm focal-plane resolution）STED技術(shù)的不足之處在于光學(xué)系統(tǒng)實現(xiàn)起來比較困難，需要非常強的STED激光來抑制受激點光源的激發(fā)。因此， Stefan進一步對這個系統(tǒng)進行了改進，他找到了一些具有可反復(fù)激發(fā)淬滅特性的熒光分子，利用其特性，將STED激光以高頻藍光代替，使得激發(fā)光束中心的點光源周邊的分子非?？焖俚谋淮銣?，待中心點光源成像后再移動光束進行下一個位置的激發(fā)-淬滅循環(huán)。這個改進中使用的高頻藍色激光所需要的能量較STED激光縮小了千倍，大大降低了對光學(xué)系統(tǒng)的要求。利用

22、這種原理， Stefan小組進一步發(fā)明了GSDIM(ground state depletion with individual moleculereturn)，可利用多種小分子進行超高分辨率顯微成像，可以得到5070 nm的分辨率。但是為使這些小分子可以反復(fù)激發(fā)和淬滅，需要在溶液中添加一種溶解氧消耗系統(tǒng)以及脂肪族巰醇，使得其無法應(yīng)用于長時間的活細胞觀察。而后來發(fā)現(xiàn)的一些可反復(fù)激活型熒光蛋白，使得該方法在活細胞層次上的應(yīng)用得到了進一步加強。圖2：STED超高分辨碼率成像技術(shù)3.4 飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)SSIM改變光學(xué)的點擴散函數(shù)來突破光學(xué)極限的另一個 方 法 是 利 用 飽 和 結(jié) 構(gòu) 照 明

23、 顯 微 技 術(shù)(saturated structure illumination microscopy, SSIM)早在 1963年， Lukosz 和 Marchand就提出了特定模式側(cè)向入射的光線可以用來增強顯微鏡分辨率的理論2005 年，加州大學(xué)舊金山分校的 Gustafsson 博士首先將非線性結(jié)構(gòu)性光學(xué)照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微鏡上，得到了分辨率達到 50 nm 的圖像。SSIM技術(shù)的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息，如圖4所示。（參考文獻：呂志堅，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進展；候尚國.基于多種非線性效應(yīng)的超分辨

24、成像研究)圖4：通過衍射的莫阿干涉效應(yīng)來提高分辨率當(dāng)一個未知結(jié)構(gòu)的物體(a)被一個結(jié)構(gòu)規(guī)則的照射模式(b)的光所照射時，會產(chǎn)生云紋條紋(moiré fringes)(c)云紋條紋發(fā)生在采樣物體的空間頻率與照射光線的空間頻率有差異的地方顯而易見，在顯微鏡下直接觀察，就可以看到它放大了原先不能夠分辨出來的樣本結(jié)構(gòu)通過計算機進一步分析所有條紋中包含的信息，可以重組出樣本的高分辨率圖像。四 超高分辨率成像技術(shù)的發(fā)展趨勢4.1 z平面軸向的超高分辨率需求以上所討論的幾種超分辨率成像方法，其分辨率的改進都在 xy 平面而事實上，由于傳統(tǒng)顯微鏡在光傳播方向上(z 軸)的點擴散函數(shù)的半高寬大約為 2

25、nsin2 ，小于 xy 平面的半高寬 2nsin，因此其理論 z 軸分辨率本來就低于其 xy 平面的分辨率另外，對厚的生物樣本進行顯微三維成像時，由于樣本本身的折射系數(shù)與物鏡的折射系數(shù)不同，在 z 軸方向上產(chǎn)生顯著的球面象差(spherical aberration)，從而使圖像在 z 軸上的分辨率降低如果要充分觀察細胞內(nèi)的三維精細圖像，就必須大幅度提高成像的 z 軸分辨率因此，近年來，國際上各個研究超分辨率顯微成像的小組也不斷地探索提升 z 軸分辨率的手段。（參考文獻：孫育杰，陳軒澤.淺談2014年諾貝爾化學(xué)獎：超高分辨率熒光顯微成像）4.2 超高分辨率顯微技術(shù)發(fā)展趨勢與 21 世紀初相比，三維超分辨率顯微成像已有很大的發(fā)展，有多種不同成像技術(shù)實際應(yīng)用于生物系統(tǒng)的范例，甚至已經(jīng)出現(xiàn)了商業(yè)化的超分辨率顯微成像系統(tǒng)但是，目前的成像模式仍然遠遠沒有達到完美狀態(tài)，對于固定樣本成像其三維分辨率還沒有達到可以和電子顯微鏡相媲美的幾個納米的范圍當(dāng)前的發(fā)展趨勢是結(jié)合不同成像模式的優(yōu)點，進一步提高成像的精度和準(zhǔn)確