定量PCR中ROX作用

1、使用Rox?的好處 一確保您獲得均一的定量PCF實(shí)驗(yàn)結(jié)果。某些不含有Rox?均一化參比染料，或是無(wú)法在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用參比染料的定量PCF平臺(tái)，常常試圖貶低使用參比染料的價(jià)值。然而事實(shí)是，在定量 PCF反應(yīng)過(guò)程中Rox?染料是一種非常有價(jià)值的工具，能帶來(lái) 以下多方面好處：校正單次反應(yīng)運(yùn)行中由于泡沫或蒸發(fā) /冷凝而導(dǎo)致的信號(hào)改變；為故障分析提供一項(xiàng)強(qiáng)有力的診斷工具：每次循環(huán)采集參比染料信號(hào)，不受PCR反應(yīng)影響；均一化校正由于移液誤差或蒸發(fā)所導(dǎo)致的批內(nèi)體積差異；均一化校正批間體積差異，提供更連續(xù)一致的批間重復(fù)Ct值。美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems） 認(rèn)識(shí)到均一化工具（R

2、ox?參比染料）的好處，并在所有 AB定量 PCF儀上優(yōu)化，以便實(shí)驗(yàn)人員充分利用 Rox?參比染料所帶來(lái)的好處。此外，所有 AB生產(chǎn)的Real-TimePCR Master Mix試劑液都預(yù)摻入最合適量的 Rox?參比染料，從而確保每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)反應(yīng)都獲得最好的結(jié)果。Rox?校正單次反應(yīng)運(yùn)行中的信號(hào)改變?cè)诶硐敕磻?yīng)條件下，報(bào)告熒光染料的信號(hào)值起始于基線，當(dāng)反應(yīng)體系中存在合適的靶分子時(shí)，報(bào)告熒光染料會(huì)隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生岀一條典型的擴(kuò)增曲線，儀器軟件通過(guò)擴(kuò)增曲線計(jì)算結(jié)果。如果擴(kuò)增曲線只是簡(jiǎn)單地根據(jù)報(bào)告染料的熒光信號(hào)而繪制，將會(huì)難以區(qū)分樣品的真實(shí)差異和隨機(jī)反應(yīng)條件帶來(lái)的人為差 異?，F(xiàn)實(shí)中，有許多

3、事件可能影響報(bào)告熒光染料的表現(xiàn)：泡沫會(huì)形成熒光信號(hào)尖峰；蒸發(fā)或冷凝會(huì)造成反 應(yīng)體系濃度改變，導(dǎo)致不同反應(yīng)批次間熒光信號(hào)值增強(qiáng)或減弱（見(jiàn)圖1）。這類(lèi)事件會(huì)同時(shí)影響報(bào)告熒光染料和Rox?參比染料，所以使用 AB的定量試劑與儀器時(shí)，根據(jù)Rn值繪制擴(kuò)增曲線，采集的是報(bào)告熒光染料減去Rox?參比染料的熒光差值，任何潛在的人為誤差因素都被均一化，從而排除在最終結(jié)果之外。圖1 :多組分圖顯示Rox?信號(hào)和報(bào)告染料信號(hào)一同抬起，結(jié)果指示存在蒸發(fā)Rox?提供強(qiáng)大的故障分析工具Rox?參比染料作為故障分析工具的價(jià)值同樣不應(yīng)被低估。如果一個(gè)反應(yīng)失敗了，依靠Rox?參比染料確保在反應(yīng)過(guò)程中有持續(xù)不變的信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)十分重要

4、。Rox?信號(hào)可以提供反應(yīng)設(shè)置的信息提示：無(wú)Rox?信號(hào)，很明確地表明沒(méi)有放置 MasterMix試劑；異常大的信號(hào)值強(qiáng)度差異，提示可能放置了2倍反應(yīng)體系；Rox?信號(hào)不規(guī)則變化，提示可能存在儀器故障。AB公司的技術(shù)支持在故障排除工作中總會(huì)使用RoX?參比染料，以幫助在更短時(shí)間內(nèi)獲得更多信息量的檢測(cè)結(jié)果。Rox?均一化反應(yīng)體積差異同時(shí)也證明AB定量P以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了 Rox?參比染料在校正移液誤差所導(dǎo)致的反應(yīng)間均方差上的價(jià)值,CR儀器在使用或不使用 Rox?參比染料都能獲得很好的性能表現(xiàn)和精確性。實(shí)驗(yàn)一：獲得高精確性不一定需要Rox?從AB RNase P Instrument verifi

5、cation Plate中取出反應(yīng)混合液，分別移液入對(duì)應(yīng)的Fast 96 孔板中。在AB 7500 Fast Real-Time PCR 儀上運(yùn)行這塊板。數(shù)據(jù)分析分別采用2組模式，一組為正常的減去Rox?參比染料，另一組將參比染料設(shè)置成“None”，從而顯示使用Rox?信號(hào)均一化處理數(shù)據(jù)的價(jià)值。技術(shù)重復(fù)（24次重復(fù)）的結(jié)果顯示，使用 Rox?和不使用Rox?都得到了很好的結(jié)果。使用Rox? 一組的Ct值SD（標(biāo)準(zhǔn)偏差），不使用Rox? 一組的Ct值SD（標(biāo)準(zhǔn)偏差）（見(jiàn)圖2）。圖2 :技術(shù)重復(fù)的擴(kuò)增曲線，分別采用Rox?校正（2A）和不采用Rox?校正（2B），顯示重復(fù)的結(jié)果聚合緊密，散布很小。

6、實(shí)驗(yàn)二：Rox?均 一化處理校正移液錯(cuò)誤通過(guò)系統(tǒng)地減少?gòu)?RNase P Plate中移出的樣品，加入分子純級(jí)水補(bǔ)齊體系，來(lái)模擬移液錯(cuò)誤對(duì)運(yùn)行精確性的影響。圖2描繪了實(shí)驗(yàn)一中的原體積樣本，以及3個(gè)移液錯(cuò)誤重復(fù)：分別含，和卩l(xiāng) of ddH20（樣本體積相應(yīng)減少）。數(shù)據(jù)分析時(shí)使用Rox?參比染料校正初始濃度差異（由移液錯(cuò)誤導(dǎo)致的），得到的Ct值SD（標(biāo) 準(zhǔn)偏差）為；而不使用Rox?參比染料校正的 Ct值SD（標(biāo)準(zhǔn)偏差）為（見(jiàn)圖3）。圖3 :技術(shù)重復(fù)與3重模擬樣本移液錯(cuò)誤（分別用，和卩l(xiāng) ddH2O替代等量樣本模板）的擴(kuò)增曲線。使用 Ro x?可以校正起樣本始體積（或濃度）的輕微差異（3A），而不

7、使用Rox?時(shí)可以明顯看到輕微的散布（3B）。實(shí)驗(yàn)三：Rox?均 一化處理確保定量反應(yīng)精確性相似地，直接從RNAse PPlate中移出反應(yīng)混合液進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較使用Rox?和不使用Rox?分析時(shí)的精確性差異（見(jiàn)圖4），結(jié)果R2值分別是和。圖4 :重復(fù)RNAseP標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，數(shù)據(jù)分析時(shí)分別用Rox?(4A)和不用RoX?(4B)，結(jié)果表現(xiàn)都很好。當(dāng)反應(yīng)體系中部分樣品被1卩l(xiāng)ddH20替代，RoX?均一化處理能夠校正此類(lèi)小錯(cuò)誤，而當(dāng)分析不包含RoX?參比染料校正時(shí)，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)組中很明顯地出現(xiàn)了更大的點(diǎn)散布(見(jiàn)圖5和表1) o表1：計(jì)算重復(fù)進(jìn)行 RNAseP標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，將其與1卩l(xiāng)反應(yīng)混合液被ddH2O取代的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果比較。使用Rox?校正可有效減少錯(cuò)誤。圖5:重復(fù)RNAseP標(biāo)準(zhǔn)品，及模擬移液錯(cuò)誤樣本(1卩l(xiāng)反應(yīng)混合液被ddH2O取代)，繪制擴(kuò)增曲線。數(shù)據(jù)分析時(shí)分別使用Rox?(5A)和不用RoX?(5B)，證明RoX?可以校正由輕微起始樣本濃度或反應(yīng)體積錯(cuò)誤而造成的差異。表1顯示了各個(gè)濃度重復(fù)反應(yīng)的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。其中，直接從 RNAsePplate中移出反應(yīng)混合液進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，使用Rox?或不使用RoX?所得