基因工程方法生產(chǎn)乙肝疫苗

1、重組乙肝疫苗的研制生產(chǎn)過(guò)程、理化性質(zhì)、生物學(xué)活性、臨床應(yīng)用國(guó)際上先后研制出了 第一代血源性乙肝疫苗和 第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝 疫苗主要運(yùn)用乙肝病毒攜帶者血清中提取純化出的的乙肝病毒表面抗原，先后經(jīng)過(guò)減毒處理和添加佐劑后注入人體預(yù)防接種。但是由于對(duì)血源性疫苗安全性存在顧慮，人們進(jìn)一步著手開(kāi)發(fā)第二代乙肝疫苗，也就是基因重組疫苗。第一步是 分離目的基因，獲得目的DNA片段的方法主要有兩種，一是直接 從細(xì)胞基因組中分離，二是人工合成。第二步是將DNA片段和載體在體外連接 重組，成為重組DNA分子，多采用連 接酶的方法連接。第三步是基因克隆，即將重組體DNA分子，引進(jìn)合適的宿主細(xì)胞（大腸桿菌

2、、酵 母）中增殖。根據(jù)所用載體的不同，可選用轉(zhuǎn)化（以質(zhì)粒作載體時(shí)，重組體 DNA分子以此種方式進(jìn)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，以獲得轉(zhuǎn)化子菌落）、轉(zhuǎn)染（入噬菌體作載體時(shí)，構(gòu)成的重組體DNA分子，以此種方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，可轉(zhuǎn)染得到噬菌斑）、轉(zhuǎn)導(dǎo)（入噬菌體DNA與外源DNA組成的重組體DNA分子，與噬菌體蛋白組裝成具有感染力的噬菌體顆粒，即 人工包裝的噬菌體顆粒，弓I入宿主細(xì)胞）的方法，往宿主細(xì)胞引入重組體DNA分子。第四步是目的基因克隆的篩選與鑒定 ，即從大量攜帶重組體 DNA分子的細(xì)胞中 分離出帶目的基因的細(xì)胞。因?yàn)椴皇撬械募?xì)胞都能獲得重組體DNA分子，為了獲得攝取了重組體DNA分子細(xì)胞，需經(jīng)篩選，才

3、能將其與未攝取重組體DNA分子的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)，并作進(jìn)一步鑒定。篩選含有重組體DNA分子細(xì)胞的方法，一般都是以載體DNA及目的基因的遺傳標(biāo)記及分子特征為依據(jù)，并結(jié)合受體細(xì)胞的基因表型而建立起來(lái)的。由于許多質(zhì)粒都具有抗生素等藥物的抗性標(biāo)記，因此，在含有一定濃度抗生素的選擇培養(yǎng)基上，可以很容易地把攝取了重組體DNA分子，因同時(shí)也獲得了抗生素抗性的細(xì)胞辨認(rèn)出來(lái)。但藥物篩選只是一個(gè)方面，依據(jù)它只能判斷質(zhì)粒載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，還不能確定受體細(xì)胞是否攝取了含有目的基因的重組體DNA分子。對(duì)于重組體DNA分子的鑒別，通常是在抽提出重組質(zhì)粒DNA后，用凝膠電泳法或電鏡觀察其分子大小，用限制酶酶解，觀察其酶切

4、圖譜進(jìn)行。 還可采用菌落原位雜交法來(lái)進(jìn)行鑒定，即將菌落從最初生長(zhǎng)的平板上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用堿裂解濾膜上的菌落，使DNA分子游離，變性，并固定在濾膜上，隨即用同位素標(biāo)記的與目的基因互 補(bǔ)的DNA或RNA探針雜交，最后通過(guò)濾膜的放射自顯影鑒定菌落，并從最初生長(zhǎng)的平 皿上挑選出放射自顯影呈陽(yáng)性的菌落。第五步是基因表達(dá)，這是指宿主細(xì)胞在大量繁殖過(guò)程中外源DNA在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)生成的產(chǎn)物 （蛋白質(zhì)），最好在細(xì)胞內(nèi)不被分解，而分泌到細(xì)胞外面。 表達(dá)產(chǎn)物若為較小的多肽，或是對(duì)細(xì)菌蛋白酶極為敏感的蛋白質(zhì)，形成后，通常即被迅速降解。為了保證外源基因表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外而不被降解，通?？梢?/p>

5、把外源基因插入在載體的某些結(jié)構(gòu)基因中間，在這種情況下，表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白質(zhì)， 融合蛋白質(zhì)可以抵抗內(nèi)源蛋白酶的降解，又可以在細(xì)胞信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到細(xì)胞外。最后，利用發(fā)酵工程培養(yǎng)重組與乙肝疫苗的工程菌理化性質(zhì)從熱穩(wěn)定性方面說(shuō)酵母源乙型肝炎疫苗37 C保存1周不改變其免疫原性乙肝疫苗，主要成分是45個(gè)氨基酸的多肽，通過(guò)化學(xué)合成的方式制備，使用直接注射 的方法打入靜脈。這45個(gè)氨基酸分別編碼了三個(gè)抗原表位(所謂表位，是一串大于9個(gè)氨基酸的多肽，是能夠刺激免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的最小多肽片段)：,HBscFv等電點(diǎn)理論值為8.5 1,實(shí)驗(yàn)值為7.38.1 (就是抗體)綜上所述，用基因工程法生產(chǎn)乙肝疫苗要先后

6、將過(guò)獲取目的基因、構(gòu)建重組質(zhì)粒、構(gòu)建基因工程菌、培養(yǎng)工程菌、乙肝病毒表面抗原的分離純化、產(chǎn)品多項(xiàng)性質(zhì)的初步檢測(cè)、 成品化處理(如添加佐劑、抗生素、除菌)、成品檢測(cè)鑒定、包裝幾個(gè)步驟。對(duì)產(chǎn)品多項(xiàng)性質(zhì)的檢測(cè)對(duì)于保證疫苗的安全性尤其重要。目前臨床上應(yīng)用的乙肝疫苗主要有以下幾種：(1 )血源性乙肝疫苗：此疫苗是用無(wú)癥狀的HBsAg攜帶者的血液制成，故 稱血源性乙肝疫苗。它的制備步驟大致是：采用高滴度HBsAg陽(yáng)性攜帶者血液， 分離出血漿并除去其中有感染的HBV顆粒后，再將HBsAg予以濃縮與純化，充 分滅活，以消滅其中可能存在的一切已知病毒和消除HBsAg表面可能存在的全 部宿主蛋白，然后添加佐劑及防

7、腐劑而成。為確保疫苗的安全，每一階段均取 樣做無(wú)菌試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)及動(dòng)物安全試驗(yàn)等，以檢查疫苗中有無(wú)其他病原體及 血液中的抗原物質(zhì)。此種疫苗的免疫原性與安全性均已獲得解決。(2)基因工程疫苗：利用基因工程研制重組DNA乙肝疫苗，曾先后研制過(guò) 大腸桿菌系統(tǒng)、啤酒酵母細(xì)胞系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)和牛痘病毒系統(tǒng)的重組 乙肝疫苗。目前多用酵母基因的重組疫苗。其具有良好的免疫原性，免疫應(yīng)答 特點(diǎn)與血源性乙肝疫苗基本相似，且多無(wú)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。(3 )含前S蛋白的乙肝疫苗：目前臨床上應(yīng)用的血源性疫苗與基因工 程疫苗，均只含HBsAg蛋白，當(dāng)證實(shí)S蛋白能增強(qiáng)HBsAg的免疫應(yīng)答后，又注 意到單純只含HBsAg蛋

8、白的疫苗對(duì)血液透析病人與新生兒免疫效果較差時(shí)，遂 生產(chǎn)出添加前S蛋白的酵母源性重組乙肝疫苗，它確能明顯地增強(qiáng)免疫應(yīng)答。J jiL pWLA-5 I i: p«a« ytra RiUGATIONI倂2pHVB- 3200LKZ-A： g p囲KmAtX |/co ci / L眠口陣爲(wèi) ACHI b 冒 P E0OlM Hf hWillBf fI； pHBM h'| jpH85 16> prmTTX* c*< < *' |.> L c< ' * 樸T，r”.”i r：-*tA* ，h FTT'ZTKXf* CSC WIrH"湖詒小切圖1乙肝病毒表面蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程技術(shù)生產(chǎn)乙肝疫苗首先要選擇表達(dá)HBsAg的載體系統(tǒng)。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，若選用細(xì)菌為基因表達(dá)載體，即使使用強(qiáng)啟動(dòng)子，也不能得到大量具有免疫原性的基 因表達(dá)產(chǎn)物。這可能是由于原核表達(dá)系統(tǒng)中不能進(jìn)行糖基化修飾，或者原核細(xì)胞環(huán)境不適合專性寄生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表達(dá)，故應(yīng)選用真核表達(dá)系統(tǒng)。選用酵母(Saccharomyces cerevisiae )作為宿主系統(tǒng)，因其具有豐富的膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的特點(diǎn)， 既可使蛋白以分泌形式表達(dá)，又可以使蛋白糖基化變?yōu)榛钚孕问?。克隆載體構(gòu)建時(shí)，將編碼HBsAg