雞蛋中溶菌酶的提取.總結(jié)

1、雞蛋中溶菌酶的提取，純化及純度鑒定李瑩姝蔣華云 *（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210046 ）摘要：從蛋清中用 724 弱酸性陽離子交換樹脂提取溶菌酶， 然后用硫酸銨溶液洗脫，鹽析得到溶菌酶。用葡聚糖凝膠層析（ SephadexG-75）純化溶菌酶，收集峰值處樣品。用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠（ SDS-PAGE）電泳鑒定個(gè)步驟留樣及所得溶菌酶樣品的純度。溶菌酶得率為 0.0474mg/100ml（0.03g/kg ）；葡聚糖凝膠層析過程純化樣品得到了洗脫峰曲線， 但未能收集到峰值處樣品； 電泳結(jié)果顯示在純化過程中溶菌酶純度不斷升高。本實(shí)驗(yàn)溶菌酶得率較低，提取工藝有待改進(jìn)，需進(jìn)一步減少樣品損

2、失；層析過程需進(jìn)一步熟練掌握，以更好達(dá)到純化效果。關(guān)鍵詞：溶菌酶；離子交換樹脂，凝膠層析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings LiHuay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resinextraction of lysozyme, and then elut

3、ed with ammonium sulfate, saltingto be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purifiedlysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel(SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purityof the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/10

4、0ml (0.03g/kg);dextrangelchromatographypurifiedsamples obtained during elutionpeakcurve,butfailed to collectsamples at thepeak; electrophoresisshowedthat the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In thisstudy,lysozyme was the low rate ofextractionprocess could be improved,the need t

5、o further reduce sample losses; chromatography process needsfurther proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶 ( Lysozyme , 1,4 N溶菌酶 ) 是一種專門作用于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的 -1,4- 糖苷鍵的水解酶 , 因而又稱為胞壁質(zhì)酶或者 N-胞壁質(zhì)聚糖水解酶。 溶菌酶在臨床上是有效的消炎劑 , 在食品防

6、腐和基因工程等方面也有廣泛的應(yīng)用。 1 2溶菌酶來源廣泛 , 人、動(dòng)物、植物和微生物中均有發(fā)現(xiàn) , 其中雞蛋清中含量較高 , 因此 , 工業(yè)生產(chǎn)溶菌酶常以雞。 蛋清為原料雞蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一種溶菌酶 3 ，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 純品為白色或微黃色結(jié)晶體， 易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一種分子量在 1415kD，等電點(diǎn) pH 值在 11.0 左右，最適效應(yīng)溫度在 50，最適 pH 值為 6.0 7.0 的堿性球蛋白。它的生物化學(xué)功能是催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的水解， 從而溶解這些細(xì)菌的細(xì)胞壁。 溶菌酶的抗菌及抗病毒活力與 pH 值有關(guān)，在酸性介質(zhì)中，活力顯著增強(qiáng)。當(dāng)前 , 溶菌酶的制備有

7、多種方法，最常用的是離子交換樹脂吸附法 4 。溶菌酶的用途很多， 由于它本身是一種天然蛋白質(zhì)， 無毒性，可以作為防腐劑、保鮮劑。在醫(yī)藥上，溶菌酶具有多種藥理作用，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。溶菌酶是基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程中必不可少的工具酶， 國外多用于菌體內(nèi)容物質(zhì)的提取， 在發(fā)酵工業(yè)上是一種重要的溶菌劑，用于破壞細(xì)胞壁， 制備無菌提取液。 溶菌酶所具有的廣泛用途吸引了國內(nèi)外眾多學(xué)者對其進(jìn)行研究，已發(fā)表不少關(guān)于溶菌酶的試驗(yàn)報(bào)道。1 材料和方法1.1 材料與儀器新鮮雞蛋 3 顆, 購自市場； 724 型酸性陽離子交換樹脂；滅菌紗布； 1 mol/L NaOH，1 mo

8、l/L HCl；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室桶裝水）；磷酸緩沖液（ pH 6.5 ，0.15M）；10（ NH4）2 SO4溶液；固體（ NH4）2SO4 ； BaCl2 ； 12 分離膠； 4濃縮膠； Tris- 甘氨酸電極緩沖液； loading Buffer ；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker ；染色液（考馬斯亮藍(lán) G-250）；脫色液（ 冰乙酸，甲醇 ）；葡聚糖凝膠（ SephadexG-75）；藍(lán)色葡聚糖 -2000 （2mg/mL）； G-75 洗脫液（ KCl， HAc）電子分析天平；真空泵；超聲振蕩器；布氏漏斗，循環(huán)水式多用真空抽濾泵；玻璃棒，冰水浴，吸管，普通離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)；透析袋，磁子，磁

9、力攪拌器，玻璃層析柱（ 20mm×15cm），恒流泵，細(xì)滴管， Bio-Rad 層析系統(tǒng)設(shè)置，部分收集器；水浴鍋； Bio-Rad 垂直電泳系統(tǒng)（制膠系統(tǒng)、電泳槽）；脫色搖床；可見分光光度計(jì) (UV-1100 型) ；紫外分光光度計(jì)；微量移液器； 4冰箱；容量瓶；精密 pH 試紙；等。部分試劑詳細(xì)配方及配法見附錄I1.2 實(shí)驗(yàn)方法陽離子交換法提取溶菌酶樹脂預(yù)處理：干樹脂清水浸泡，使其充分膨脹并除去細(xì)小顆粒和較大雜質(zhì)；1 mol/L的 HCl 浸泡 2 h ，去離子水洗 3 次至至近中性；抽濾收集樹脂,1 mol/L的 NaOH溶液浸泡 2 h，去離子水洗 3 次至近中性；抽濾收集樹脂

10、 , 加 0.15 mol/L 、 pH 值為 65 的磷酸緩沖液平衡過夜待用。蛋清制備：將 3 個(gè)新鮮雞蛋洗凈干燥， 小端敲一個(gè)小洞， 大端打一個(gè)小孔進(jìn)氣，分離得雞蛋清，用 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) PH到 7。過濾前稱量燒杯重 48.7g ，緩慢攪拌用滅菌的兩層紗布過濾除去臍帶塊和碎蛋殼等， 蛋清與燒杯總重 207.5g ，蛋清凈重 158.8g 。用 1 mol/L 的 HCl 溶液調(diào) pH 值至 7.0 ，量蛋清體積為 100 ml。在調(diào)節(jié) PH時(shí)蛋清中出現(xiàn)少量白色沉淀，可能為部分蛋白由于局部過酸而變性。吸附：蛋清在不斷攪拌下加入抽濾好的724 樹脂 25g（相當(dāng)?shù)扒逅姆种惑w積的

11、樹脂），冰水浴中磁力攪拌器緩慢攪拌（使樹脂全部懸浮在雞蛋清中，攪拌不能起泡）吸附2.5 h ，4靜置 1.5h 。然后 3000r/min 離心 15min 分層，收集樹脂，回收蛋清（留樣A）。去除雜蛋白：收集樹脂用去離子水振蕩水洗直至洗液澄清 （至無白沫為止），吸管輕吸去洗液，以去除雜蛋白。 （每洗 1 次，離心 1 次，總共 3 次）冰浴中用等體積的 0.15mol/L 、pH =6.5 的磷酸緩沖液攪拌洗滌 15min，抽濾，重復(fù)洗三次，注意防止樹脂流失。最后一次抽濾濾除樹脂水分至干燥。洗脫溶菌酶：樹脂中加入 35ml（等體積）的 10（ NH4）2 SO4溶液攪拌洗脫 30 min，抽

12、濾 , 使溶菌酶從樹脂上洗脫下來， 重復(fù)兩次，合并收集洗脫液（留樣），洗脫液過濾后，準(zhǔn)確量取體積 100ml。（留樣 B）鹽析 : 每 83mL洗脫液加 32g 磨細(xì)的固體（ NH4）2SO4，本實(shí)驗(yàn)中總量為 38.55g 。緩慢加入（ NH4） 2SO4攪拌待完全溶解后保鮮膜封口，置于4冰箱鹽析過夜。透析 : 待白色沉淀析出， 3000r/min 離心 15 min ，收集沉淀，用去離子水將沉淀洗下并全部溶解 （4.5ml 去離子水），裝于透析袋中， 于去離子水中透析 （冰浴），期間 2 次更換去離子水，直至用 BaCl2 檢測透析完全。透析裝置中加入磁子，于磁力攪拌器中攪拌加快透析速度。去

13、雜質(zhì)蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl調(diào)整 pH4.6，產(chǎn)生少量白色沉淀（留樣 D），可能為雜蛋白。 3000r/min 離心 10min，收集上清液（留樣 C 20ul ）。濃縮：用 PEG-20000濃縮上清液至 1.5ml （留樣 E，20ul ，加 loading buffer, 出現(xiàn)黃色（可能為濃縮時(shí)透析袋中滲入了 PEG-20000）。 5 6溶菌酶的純化凝膠溶脹及預(yù)處理 : 取足量 SephaexG-75于燒杯中加入 20 倍體積洗脫液，置室溫溶脹 2 天。反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒，并泵脫氣；洗脫液用超聲脫氣完全。測柱床總體（ Vt ）：取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在

14、鐵架臺(tái)上。在距柱上端約 3cm處作一記號，關(guān)閉柱出水口，加入去離子水，打開出水口，液面降至柱記號處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接住柱中去離子水（水面降至層析玻璃篩板），讀出的體積即為柱床總體積 Vt=32.5 ml 。裝柱：在柱中注入已脫氣洗脫液（約 1/3 柱床高度），將溶脹好的凝膠與洗脫液 1：3 混勻稀釋后緩慢傾入柱中， 待凝膠沉積約 1cm2cm高度后打開出水口，常壓平衡，膠面上升到柱記號處則裝柱完畢， 注意裝柱過程中凝膠不能分層。 然后關(guān)閉出水口， 靜置過夜， 等凝膠完全沉降。 過夜后的凝膠柱內(nèi)顆粒大小分布均勻，松緊一致，填料微孔中無氣泡，連接處無死體積。預(yù)加樣：在膠面上覆蓋一層濾紙，接

15、恒流泵，用 2 倍床體積的洗脫液以 0.5ml/min 流速平衡柱子，使柱床穩(wěn)定，期間測定流速是否與預(yù)設(shè)的一樣，并趕走系統(tǒng)中的氣泡。用另一支相同的層析玻璃管與層析柱對比得到外水體積為26.5ml 。吸去柱上端的洗脫液，打開出水口，使殘余液體降至與膠面相切（不要干膠），關(guān)閉出水口。 用細(xì)滴管吸取 1.0 mL藍(lán)色葡聚糖 -2000 沿管壁緩慢加入，打開出水口， 等藍(lán)色葡聚糖滲入膠床與膠面相切時(shí)， 關(guān)閉出水口， 用少許洗脫液加入柱中，柱上端再用洗脫液充滿后用 0.5mL/min 的速度開始洗脫。 收集洗脫液沒管 1.0 ml 。手動(dòng)記錄時(shí)間與對應(yīng)的OD280 并繪制曲線。葡聚糖色帶狹窄、均勻平整，

16、層析柱性能良好。藍(lán)色葡聚糖洗下來之后，用洗脫液(1倍床體積 ) 繼續(xù)平衡一段時(shí)間。加樣和洗脫：按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶樣品溶液1.0 mL，用 Bio-Rad層析系統(tǒng)設(shè)置洗脫條件， 以約 0.5mL/min 的速度洗脫并收集洗脫液每管 0.5 ml。手動(dòng)記錄時(shí)間及檢測到的洗脫液在 A280nm處的吸光值。將收集管編號置于 4 冰箱保存 . 合并洗脫峰內(nèi)的收集管中的洗脫液。（預(yù)先測得記錄儀至部分收集器的死體積，出現(xiàn)峰值處的收集管延遲死體積所占的管數(shù)才為峰值處樣品。）溶菌酶純度鑒定制膠：電泳玻璃板洗凈，并把玻璃板在灌膠支架上固定好。將 12%的分離膠加入到電泳槽內(nèi)的兩玻璃板之間， 到上口約

17、3cm止，再加一薄層蒸餾水填滿， 趕走氣泡，水與膠面分開并且界面清晰。靜置 20min，將水倒去。將 4%的濃縮膠連續(xù)平穩(wěn)加入至剛剛沒過薄板， 趕走氣泡。 迅速從左至右插入梳子， 不要留下氣泡，靜置 30min。（取下膠版放入 PE手套，加適量蒸餾水 4保存）點(diǎn)樣：將樣品與 loading Buffer 1:1混勻。將上述處理的各級分樣品和蛋白 Marker 分別加到點(diǎn)樣槽中 5ul 。接通電源先恒壓 130V 電泳，待各樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠后恒壓 220V 繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)距凝膠邊緣 5mm是停止電泳，關(guān)閉電源。染色及脫色： 電泳完畢，將膠板從玻璃板上取下， 小心用塑料板開啟電泳厚板和

18、薄板，使膠片完整取下。 用塑料板切去濃縮膠部分， 分離膠放入大的培養(yǎng)皿用考馬斯亮藍(lán) R-250 搖床染色 20min, 回收考馬斯亮藍(lán) R-250，在培養(yǎng)皿中加脫色液脫色過夜（期間多次更換脫色液直至背景清楚，條帶清晰），并對電泳圖譜拍照記錄。蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán) G-250 法測定蛋白質(zhì)濃度。 7 先用牛血清清蛋白 （BSA）及考馬斯亮藍(lán) G-250 制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算目的蛋白濃度。附：具體組分加樣量見附錄II2 結(jié)果和分析2.1 凝膠層析純化圖 1 和圖 2 分別為藍(lán)色葡聚糖和蛋白樣品的凝膠層析洗脫圖譜。圖 1 層析條件流速 0.5ml/min, 每

19、2min 收集一管。曲線呈明顯的尖峰，而且范圍狹窄，說明層析柱性能很好。OD280 在 7、8、9 號管出現(xiàn)峰值，根據(jù)收集管顏色判斷 9、10、11 號管為峰值，由此推斷從經(jīng)過紫外檢測器測得分收集器收集到該樣品推遲體積為 2ml。OD值到由部圖 1 藍(lán)色葡聚糖凝膠層析洗脫圖譜圖 2 上可以看出， 在樣品峰值之前有其他的雜蛋白洗脫出來， 可能為清蛋白、 朊蛋白或 PEG濃縮時(shí)混入的 PEG。在層析過程中第 25 分鐘時(shí)出現(xiàn)重大失誤，發(fā)現(xiàn)凝膠柱干裂，停止洗脫，雖然記錄到峰值，但由于存在 2ml 延遲，未收集到峰值處洗脫液，只收集到 第 19 和 20min 的洗脫樣品（ 24 和 25 號管收集液

20、 , ），該處樣品處于多個(gè)蛋白洗脫峰之間，由此推斷成分復(fù)雜，目的蛋白不純。圖 2 蛋白樣品凝膠層析洗脫圖譜2.2 蛋白質(zhì)純度圖 3 和圖 4 分別為凝膠層析純化之前和之后的 SDS-PAGE電泳圖譜。圖 3 中由于留樣 A（樹脂吸附后蛋白上清液） 濃度太大并可能部分發(fā)生凝固， 且未稀釋，影響了蛋白 Maker 及其他樣品泳道的效果。 但仍然可以分辨出蛋白 Maker 的六條帶，最下面一條為溶菌酶的條帶，分子量為 143kD。對應(yīng)的 4 號和 6 號泳道蛋白樣品中分離得到的溶菌酶的條帶顏色較深， 證明粗提取得到了濃度較高的溶菌酶，但含有大量雜蛋白，主要為卵清蛋白（ 45kD）、卵白蛋白（ 66.

21、4 kD ）及其他雜蛋白，還含有少量的 PEG（20.1kD 處）。留樣 A 顯然含有大量雜志蛋白，分子量主要分布在 44.3 到 97.2 kD 之間。從圖 4 可以看出， 6 號和 7 號泳道的第 19 和 20min 的洗脫樣品即 24 和25 號管收集液，因?yàn)樘幱陔s蛋白峰值和溶菌酶峰值之間，成分復(fù)雜，顯然是不純的，主要有兩條帶，除溶菌酶外還有少量卵清蛋白。 8 號泳道為借用其他組較好的層析后樣品，可以看出純化效果較好， 五雜蛋白。9 號泳道的留樣 A 稀釋 100 倍后電泳效果較好，主要成分為雜蛋白。兩圖中雜蛋白樣品的條帶中也有少量溶菌酶， 證明溶菌酶在每一步都會(huì)不可避免的損失。 隨著

22、純度越高， 得率越低。條帶顏色的深淺一方面與酶濃度有關(guān)，另一方面與染料的選擇及濃度和染色時(shí)間有關(guān)， 一般染料濃度越高， 染色時(shí)間越長，染色越深，但脫色也更難。在本試驗(yàn)中，加樣量在 5 L 左右、固定染色 20min 比較合適，脫色時(shí)在搖床上洗脫過夜效果最好。圖 3 溶菌酶產(chǎn)品的 SDS-PAGE電泳圖譜1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker2. 留樣 A （未稀釋）樹脂吸附后蛋白上清液3. 留樣 B10（ NH4）2SO4溶液洗脫樹脂的洗脫液4. 留樣 C透析液去雜蛋白離心后的樣品5. 留樣 D透析液調(diào)節(jié) PH至 4.6 后產(chǎn)生的白色雜蛋白6. 留樣 EPEG濃縮后的樣品圖 4 層析后溶菌酶產(chǎn)品的 SD

23、S-PAGE電泳圖譜1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker2. 留樣 B10（ NH4）2SO4溶液樹脂的洗脫液3. 留樣 C透析液去雜蛋白離心后的樣品4. 留樣 D透析液調(diào)節(jié) PH至 4.6 后產(chǎn)生的白色雜蛋白5. 留樣 EPEG濃縮后的樣品6. 層析 24 號管收集樣品7. 層析 25 號管收集樣品8. 其他實(shí)驗(yàn)小組層析較好的收集樣品9.留樣 A（稀釋 100 倍）樹脂吸附后蛋白上清液2.3 蛋白質(zhì)濃度圖 5 所示為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù) R 達(dá) 0.985 ，表明線性關(guān)系較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品的溶菌酶濃度、得率等。圖 5蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線提取的蛋白樣品稀釋 10 倍后的 OD5

24、95=0.2905，代入回歸方程得到該蛋白樣品濃度為 3.16mg/ml 。由此計(jì)算蛋清中溶菌酶的得率為：3.16mg/ml × 1.5ml得率 =_=0.0474mg/100ml100ml但據(jù)參考文獻(xiàn)， 蛋清溶菌酶提取率可達(dá) 0.4g/100ml 。5 但采用本實(shí)驗(yàn)的提取方法 , 實(shí)驗(yàn)的酶得率非常低。 可能原因是離子交換劑選擇的不同， 提取個(gè)步驟中損失較多。張文會(huì)等使用將 D125陽離子交換樹脂的 Na+型、H+型混合，本實(shí)驗(yàn)使用 724 型酸性陽離子交換樹脂，吸附能力可能存在一定差異。在粗提取中用 1mol/L 的 HCl 調(diào)節(jié) PH時(shí)局部過酸使部分溶菌酶變性凝固； 在蛋清的樹脂

25、吸附使用磁力攪拌而不是手動(dòng)攪拌， 影響了吸附效果， 電泳結(jié)果顯示有微量的溶菌酶殘留在蛋清上清液中； 在去除雜蛋白的過程中流失了少量樹脂也損失了溶菌酶； 其他個(gè)步驟中都有少量含溶菌酶的溶液殘留在容器壁上，造成溶菌酶損失。3 討論3.1樹脂吸附實(shí)驗(yàn)后得知在陽離子交換層析吸附過程中 , 不能用磁力攪拌器攪拌 , 需要手動(dòng)攪拌 , 且不能攪動(dòng)太快， 不能出現(xiàn)泡沫。 因?yàn)榇帕嚢杵魇强磕Σ亮嚢?, 易將樹脂打碎 , 影響溶菌酶的吸附效果。 本實(shí)驗(yàn)吸附過程使用了磁力攪拌器攪拌，對實(shí)驗(yàn)造成了影響，直接影響了溶菌酶的得率。3.2調(diào)節(jié) PH及鹽析在用調(diào)節(jié)蛋清 PH時(shí)使用了 1mol/l 的 HCl，可能酸度過

26、高滴加速度過快，導(dǎo)致了部分蛋白局部過酸變性， 影響的得率。 吸取這次教訓(xùn)， 在用硫酸銨固體鹽析溶菌酶之前， 要把硫酸銨固體結(jié)晶研磨成細(xì)微的粉末狀， 加入時(shí)要緩慢加入， 不斷攪拌防止局部鹽度過高導(dǎo)致蛋白局部變性。 由此可見，在提取蛋白過程中加入任何溶液或固體都要極緩慢的加入， 并且攪拌，防止局部濃度過高對蛋白活性產(chǎn)生影響。3.3 透析與濃縮因?yàn)橄疵撊芙獾鞍讟悠窌r(shí)沒能控制好蒸餾水用量， 且透析過程使樣品溶液體積進(jìn)一步增加， 因此用 PEG-20000濃縮蛋白樣品。 可能是由于透析袋沒有扎緊或透析袋本身的問題， PEG-20000進(jìn)入到透析袋，與蛋白樣品混在一起，這樣必然影響目的蛋白的純度并可能影響

27、溶菌酶的活性。3.4 溶菌酶凝膠層析本實(shí)驗(yàn)?zāi)z層析中凝膠柱是自己手動(dòng)填充的，這一步非常重要，裝柱的質(zhì)量直接關(guān)系到分離樣品的成敗。柱子應(yīng)固定在穩(wěn)定的支架上, 并保證其垂直，同時(shí)需尋找合適體積的洗脫液與凝膠灌入柱中，注意不能出現(xiàn)斷層現(xiàn)象， 再經(jīng)常壓平衡過夜，加壓平衡2 小時(shí)，用藍(lán)色葡聚糖 -2000 檢驗(yàn)，藍(lán)色色帶狹窄均勻，才算順利制備出凝膠柱。本實(shí)驗(yàn)?zāi)z柱制備非常成功，凝膠柱性能良好。層析過程所用的洗脫液一定要超聲脫氣 1 小時(shí)以上，脫氣后不要震蕩， 不要傾倒混合，一面在此混入氣體，已脫氣的要用保鮮膜封口，以免混入雜質(zhì)。層析系統(tǒng)的入口管要保證完全沒入洗脫液。實(shí)驗(yàn)最大的遺憾是在樣品層析時(shí)發(fā)生凝膠柱

28、干裂， 雖然已記錄到峰值， 但由于體積延遲未收集到峰值處電泳純的樣品。 分析原因可能是系統(tǒng)接口處漏氣， 凝膠柱產(chǎn)生負(fù)壓而進(jìn)入空氣。 當(dāng)時(shí)兩名同學(xué)忙于記錄數(shù)據(jù)及收集樣品， 未及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題。這是一次深刻的教訓(xùn)，任何實(shí)驗(yàn)中如果出現(xiàn)一點(diǎn)差錯(cuò)，就可能前功盡棄，3.5 SDS-PAGE電泳電泳是本實(shí)驗(yàn)的眼睛， 用來檢測每一步驟中樣品是否存在， 純度如何，以及去除的雜蛋白成分如何，多條電泳條帶進(jìn)行多重、兩兩比較、橫向及縱向比較，幫助分析提取效果， 凝膠層析純化及蛋白質(zhì)得率。 出現(xiàn)問題可以從電泳圖譜上尋找問題的根源。電泳過程中還要注意的是點(diǎn)樣的蛋白樣品的濃度。 如果濃度較大的樣品需要適當(dāng)稀釋， 如本實(shí)驗(yàn)留樣

29、A 濃度較大，第一次電泳是未稀釋， 導(dǎo)致泳道擁擠，影響了整個(gè)膠版上其他的泳道。 第二次電泳把留樣 A 稀釋了 100 倍，得到較好的電泳圖譜。還要注意如果蛋白樣品已大量發(fā)生凝固， 不能通過電泳分析純度，因?yàn)槟痰牡鞍谉o法在膠版內(nèi)運(yùn)動(dòng)。3.6 實(shí)驗(yàn)心得從以上分析看出本次實(shí)驗(yàn)前面大部分都很順利， 只是最后層析結(jié)果令人遺憾。 總體上還算成功， 在實(shí)驗(yàn)組人員較少， 每天平均 2-3 個(gè)人的情況下作出這樣的成果實(shí)屬不易。當(dāng)然這也部分歸功于前期準(zhǔn)備較充分， 人員安排恰當(dāng)， 節(jié)省了等待時(shí)間。從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、 實(shí)驗(yàn)操作到實(shí)驗(yàn)總結(jié)我都全程參與， 既要從宏觀上把我整個(gè)實(shí)驗(yàn)，又要從細(xì)節(jié)上弄清每一步的實(shí)質(zhì)， 這對我來說是

30、一個(gè)很好的鍛煉。 參加實(shí)驗(yàn)的同學(xué)從中學(xué)到了很多東西， 實(shí)驗(yàn)技巧得到提升， 也明白了任何實(shí)驗(yàn)不會(huì)一帆風(fēng)順，需要實(shí)驗(yàn)者不斷地探索。同學(xué)之間關(guān)系更加融洽，團(tuán)結(jié)，協(xié)調(diào)，充滿著科研的氛圍。身為本實(shí)驗(yàn)小組組長我倍感欣慰。參考文獻(xiàn)1 榮曉花 , 凌沛學(xué) . 溶菌酶的研究進(jìn)展 . 中國生化藥物雜志 , 1999, 20 ( 6) : 319- 320.2 朱奇 ,陳彥 .溶菌酶及其應(yīng)用 .生物通報(bào) , 1998, 33( 10) : 9- 10.。3 梅叢笑 , 方元超 . 溶菌酶及其在茶飲料生產(chǎn)中的應(yīng)用前景 . 天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào) ,2002(2):19-214 馬美湖 . 我國蛋與蛋制品加工重大關(guān)鍵技術(shù)篩選研究報(bào)告 . 中國蛋品科學(xué)大會(huì) , 2004: 6.5 張文會(huì)，王艷輝，馬潤宇 . 離子交換法提取雞蛋清溶菌酶 . 食品工業(yè)科技，2003，6：57-59.6 于濱，遲