堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷的工藝研究

1、堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷的工藝研究張金紅，周晶，宋慧琴，吳志麗【摘要】目的成立堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷收率的最正確工藝。方式以黃芪甲苷的收率為考察指標，采納正交實驗對黃芪甲苷的提取工藝進行優(yōu)選?？疾霳aOH度、水解時刻及料液比對黃苣甲甘收率的阻礙，采納高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD測定其含量。結(jié)果NaOH§液的濃度對黃苣甲甘的收率起要緊作用，最正確工藝條件為：NaOHS液的濃度為molL-1,室溫靜置水解2h,黃苣藥材與堿溶液的料液配比為1：12,黃苣甲甘的含量約是未經(jīng)堿水解組的倍。結(jié)論堿水解法可顯著提高黃芪藥材中黃芪甲苷的含量。方式簡便易行，有效價值高，

2、為工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】堿水解法;黃芪;黃芪甲苷;正交實驗黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge的干燥根。黃芪皂苷是黃芪的要緊藥效物質(zhì)之一，黃芪皂苷大部份是以環(huán)黃芪皂醇為苷元的皂苷，黃芪甲苷(astragalosideIV)為其要緊成份1，常作為黃苣藥材及其制劑的質(zhì)量操縱定量的指標。藥理研究說明，黃芪甲苷具有強心護心、愛惜神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)皮屏障功能、改善血液流變學(xué)、調(diào)劑機體免疫功能、抗衰老、抗胃潰瘍等功能，另外

3、，還具有降血壓、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)定、增進胰島素分泌等作用2。黃芪甲苷盡管藥理作用顯著，但其在黃芪藥材中的含量很低，提取分離較困難，使其應(yīng)用受到極大的限制。本研究利用皂化反映原理，在NaO昨用下將環(huán)黃苣醇皂甘轉(zhuǎn)化為黃苣甲甘，通過正交實驗優(yōu)選黃芪甲苷轉(zhuǎn)化的最正確條件，提高黃芪甲苷的收率，為黃芪甲苷單體制劑的研制開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。1儀器與試藥儀器Agilent1100高效液相色譜儀，Alltech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器，AT-330柱溫箱（天津奧特賽恩斯儀器），XWK-3Ag氣泵（天津市華生分析儀器廠）;SZ-93自動雙重純水蒸餾水器（上海強運科技）;BP-211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）;K

4、S-600D超聲清洗機（寧波科生儀器廠）;W2-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技）;PHS-25型酸度計（杭州亞美電子儀器廠）。試藥黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為）;黃芪藥材（購自天津市藥材公司，批號為Y0805267,由天津醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室周曄教授鑒定，符合中國藥典2005年版I部要求）;AB-8型大孔吸附樹脂（南開大學(xué)樹脂廠）;乙腈（天津康科德科技，批號：080426）色譜純，氫氧化鈉為分析純;流動相用水為重蒸水。2方式與結(jié)果色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗色譜柱：DiamonsilC18mrt250mm5m)；流動相：乙睛-水(34:66);體積流量：mlmin-1;柱溫：35

5、C;漂移管溫度：105C;載氣流量：Lmin-1;壓力：MPa;進樣量：10l。此色譜條件下，黃芪甲苷色譜峰與樣品中其他組分色譜峰可達基線分離，分離度大于，理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計不低于4000。黃芪藥材提取液的制備稱取黃芪藥材200g，置于圓底燒瓶中，各次加乙醇量別離為藥材干重的10，8，8倍，90水浴回流提取3次，各次回流時刻別離為2，1h。每次回流后趁熱過濾，濾液歸并濃縮后定容至500ml,備用。精準吸取上述提取液5ml,按設(shè)定的實驗條件進行水解后，調(diào)劑pH至中性，上AB-8型大孔吸附樹脂，流出液重復(fù)上樣一次，用3BV蒸儲水洗脫樹脂，再用4BV70%乙醇洗脫樹脂，搜集70%乙醇洗脫液，于

6、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，用70%乙醇溶解并定容于10ml量瓶中，過wm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得黃芪藥材樣品液。a.黃芪甲苷對照品;b.堿水解前樣品;c.堿水解后樣品;1.黃芪甲苷圖1黃芪甲苷標準品及黃芪藥材提取液堿水解前后的HPLC®方式學(xué)考察線性關(guān)系的考察準確稱取經(jīng)減壓真空干燥至恒重的黃芪甲苷對照品mg,置于50ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲蓄液。別離周密吸取黃芪甲苷對照品儲蓄液，1，2，4，6，8ml，置于10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，別離周密吸取上述溶液各20”,注入高效液相色譜儀，依照""項下色譜條件測定黃苣甲昔的峰面積，以黃苣甲

7、昔進樣量(wg)的自然對數(shù)值為橫坐標(X),以峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，并計算回歸方程，Y=8X+，r=8。黃苣甲昔在wg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。周密度實驗周密吸取黃苣甲甘對照品溶液10屋，注入液相色譜儀，持續(xù)進樣6次，測定黃苣甲昔峰面積值RS防(n=6),說明儀器的周密度良好。穩(wěn)固性實驗取同一份堿水解工藝制備的黃芪藥材供試液，于0，2,4,8,12,24h別離進樣，測定黃苣甲昔峰面積值RSM%(n=6),說明黃芪藥材供試液在24h內(nèi)穩(wěn)固。重復(fù)性實驗周密吸取6份黃芪藥材提取液各5ml至50ml圓底燒瓶中，依照相同的堿水解工藝條件制備黃芪藥材供試液，測定并計算黃苣甲甘的含

8、量，RSM%(n=6),說明本處置方式制備黃苣甲甘的重復(fù)性良好。加樣回收率實驗取經(jīng)堿水解工藝制備的已知黃芪甲苷含量的供試液ml至10ml量瓶中，共9份，每份別離按相當(dāng)于堿水解后黃芪供試液中黃苣甲甘含量的80%,100%,120%加入黃苣甲昔對照品溶液，加70%乙醇定容至刻度，過m微孔濾膜，取續(xù)濾液，測定并計算黃苣甲昔的回收率。結(jié)果說明，黃苣甲甘的平均回收率別離為,%和,RSDgU離為,%和。正交實驗法優(yōu)化黃苣藥材的堿水解工藝在考察了NaO嵌度，堿水解時刻和料液比等單因素對黃芪甲苷轉(zhuǎn)化率阻礙的基礎(chǔ)上，對上述因素水平設(shè)計L9（34）正交實驗，以每克黃芪生藥中含有黃芪甲苷的量（mg）作為評判指標，挑

9、選最正確工藝。各因素水平見表1。表1正交實驗因素水平表L9正交實驗樣品的制備及測定精準吸取“”中未經(jīng)堿水解的黃芪提取液5ml，按表2正交實驗條件進行水解后，繼續(xù)按“”項下操作，每次實驗平行2份。照“”項下色譜條件之外標兩點法對數(shù)方程計算黃芪甲苷的含量。結(jié)果見表2。表2正交實驗結(jié)果由表3可知，因素A（NaOH濃度）對黃苣中黃苣甲甘的收率具有顯著性阻礙（P<因素B（水解時刻）和因素C（料液比）對黃苣甲甘的收率無顯著阻礙。因此，因素A為要緊因素，因素B和C為次要因素，該結(jié)論與直觀分析法是一致的。因此，結(jié)合實際生產(chǎn)，本實驗的最正確搭配為A3B2C3即濃度molL-1的NaOHg溫靜置水解

10、2h,料液比為1：12。表3方差分析表堿水解工藝的驗證明驗為進一步考察上述最正確工藝的穩(wěn)固性及合理性，將藥材量放大10倍，即取相當(dāng)于20g黃芪藥材的提取液進行實驗，依照該工藝進行重復(fù)性實驗3次，隨行進行非水解空白組。結(jié)果見表4。表4最正確工藝驗證明驗結(jié)果由表4能夠看出，驗證明驗中黃芪甲苷的含量均高于正交實驗各組的含量，通過最正確堿水解工藝水解后的黃芪甲苷含量比未經(jīng)堿水解組明顯增高，約是未經(jīng)堿水解的黃芪皂苷樣品中黃芪甲苷含量的倍，說明本實驗確信的黃芪皂苷的最正確堿水解工藝穩(wěn)固可行，關(guān)于黃芪甲苷的生產(chǎn)具有專門大的有效價值。堿水解前后黃芪總皂苷的含量3周密稱取未經(jīng)堿水解和堿水解后提取所得黃苣皂昔粗品

11、各約mg,用無水乙醇超聲溶解并定容于25ml量瓶中，過濾，取濾液作為樣品液。周密吸取ml樣品液，各加無水乙醇至ml，再別離加入ml8%香草醛無水乙醇試劑，置于冰浴中緩緩加入ml72%(V/V)的硫酸，旋渦混勻2min，放入62水浴中，保溫30min,掏出，置冰浴冷卻10min,搖勻，當(dāng)即于波長540nm處測定吸光度，隨行試劑空白，測定3次，每一個樣品平行做3份。表5堿水解前后黃芪總皂苷的含量由表5能夠看出，黃芪皂苷堿水解前后黃芪總皂苷的含量轉(zhuǎn)變不大，采納配對t查驗，二者的不同無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能以為黃芪總皂苷堿水解前后的含量有轉(zhuǎn)變。說明該方式不阻礙黃芪總皂苷的含量，而是提高了活性較強的黃芪甲苷

12、的含量。3討論國內(nèi)外學(xué)者1對黃芪中黃芪皂苷作了深切的研究，已分離鑒定了數(shù)十種黃芪皂苷，其中大多數(shù)皂苷以環(huán)黃芪皂醇為苷元，以配糖體部份不同而分類，黃芪甲苷糖體3個位置均連著-OH，其它環(huán)黃芪醇皂苷的配糖體上連接-OH或-OAc,本研究的皂化反映原理確實是將黃苣中的環(huán)黃芪醇皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，從而提高黃芪中黃芪甲苷的收率及藥用價值。在設(shè)計正交實驗之前，本文對黃芪皂苷的水解方式進行了挑選，別離采納了加熱回流法和室溫靜置法進行黃芪提取液的堿水解，通過t查驗，結(jié)果說明，加熱回流法與室溫靜置水解法對黃芪提取液中黃芪甲苷的收率的不同無統(tǒng)計學(xué)意義，為節(jié)約本錢消耗，更適用于工業(yè)生產(chǎn)的需要，本研究選用了室溫靜置水解法對黃芪提取液進行黃芪皂苷的水解。中國藥典（2005年版）4中對黃芪甲苷含量測定的前處置中，采納了氨試液洗滌正丁醇萃取液，以使黃芪中黃芪甲苷的含量達到測定的要求，但通過反復(fù)洗滌，黃芪甲苷的損失率會大大增加，且氨試液刺激性大。有研究5采納2%ft90C水浴回流2h,用于提高黃芪中黃芪甲苷的收率，但該法中氨試液濃度較大，且加熱回流消耗本錢高，污染環(huán)境。因此，本研究采納了濃度為molL-1氫氧化鈉在室溫靜置堿水解，減少了氨試液對環(huán)境的污染，降低本錢消耗，該操作方式易于在工業(yè)生產(chǎn)中實施?！緟⒖嘉墨I】1 余灝，楊勝華.黃芪皂甙分析方式研究現(xiàn)狀J.華西藥學(xué)雜志，1993，8(3