(完整word版)SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)步驟

1、垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDS PAGE)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量的原理和基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH 條件下解離而帶電荷。當(dāng)溶液的pH 大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) (pI) 時(shí)，蛋白質(zhì)本身帶負(fù)電，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng)；當(dāng)溶液的pH 小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，在電場(chǎng)中將向負(fù)極移動(dòng)；蛋白質(zhì)在特定電場(chǎng)中移動(dòng)的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場(chǎng)強(qiáng)度等。聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不

2、同孔徑的兩層凝膠；這樣，當(dāng)含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)這兩層凝膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子在通過(guò)大孔膠時(shí)，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動(dòng)；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的區(qū)帶。這就是常說(shuō)的濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。同時(shí)，在制備上層膠(濃縮膠 )和下層膠 ( 分離膠 ) 時(shí)，采用兩種緩沖體系；上層膠pH=6.7 6.8 ，下層膠pH 8.9； Tris HCI 緩沖液中的Tris 用于維持溶液的電中性及pH，是緩沖配對(duì)離子；CI - 是前導(dǎo)離子。在 pH6.8時(shí)，緩沖液中的G

3、ly - 為尾隨離子，而在pH 8.9 時(shí)， Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH 的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進(jìn)而達(dá)到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，在進(jìn)入分離膠后，各種蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場(chǎng)中達(dá)到有效的分離。如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS) ，由于SDS 帶有大量的負(fù)電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與SDS 充分結(jié)合，

4、形成帶負(fù)電性的蛋白質(zhì)SDS 復(fù)合物；此時(shí)，蛋白質(zhì)分子上所帶的負(fù)電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場(chǎng)中移動(dòng)得愈快；反之，愈慢。蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率之間的關(guān)系是：Mr =K(10 -b · m) logMr =LogK b· Rm，式中M r蛋白質(zhì)的分子量；logK 截距；b斜率；Rm 相對(duì)遷移率。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)分子量在15,000 200,000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)之間呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率R 蛋白質(zhì)樣品的遷移距離染料( 溴m酚藍(lán) ) 遷移距離。這樣，在同一電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，把標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

5、的相對(duì)遷移率與相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)作圖，由未知蛋白的相對(duì)遷移率可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出它的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量具有簡(jiǎn)便、快速、 重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是目前一般實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法。三、試劑及主要器材1主要試劑1) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液內(nèi)含：兔磷酸化酶 B(Mw 97,400)，牛血清蛋白 (Mw 66,200)，兔肌動(dòng)蛋白 (Mw 43,000) ，牛磷酸酐酶 (Mw 31,000) 和雞蛋清溶菌酶(Mw 14,400)2)30 凝 膠貯 備 液 ：丙烯 酰 胺（ Acr ）29.2g ， 亞甲 基 雙 丙烯 酰 胺 （ Bis ） 0.

6、8g,加雙蒸水至100mL。外包錫紙，4冰箱保存， 30 天內(nèi)使用。3)分離膠緩沖液 (1.5mol L): Tris 18.17g,加雙蒸水溶解,6mol/L HCl調(diào) pH8.8,定容 100mL 。 4冰箱保存4)濃縮膠緩沖液 (0.5mol L): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl調(diào) pH6.8 ，并定容到 100mL。 4冰箱保存5)電極緩沖液(pH8.3) ： SDS lg ， Tris 3g， Gly 14.4g，加雙蒸水溶解并定容到 1000mL。4冰箱保存。6)10 SDS，室溫保存7) 質(zhì)量濃度 10過(guò)硫酸銨 ( 新鮮配制 )8) 上樣緩沖液：0.5mo

7、l L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL， 10 SDS 2mL， - 巰基乙醇1mL， 0.1 溴酚藍(lán)0.5mL ，加蒸餾水定溶至10mL。9)0.25考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液：0.25g考 馬斯 亮 藍(lán) R250 ，加 入 91ml50% 甲 醇 ，9ml冰 醋 酸10) 脫 色 液 ： 50ml 甲 醇 ， 75ml 冰 醋酸 與 875ml 雙 蒸 水混 合11) 未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mg mL )2實(shí)驗(yàn)器材1)DYCZ-24D 垂直板電泳槽( 北京市六一儀器廠)2) 電泳儀3) 長(zhǎng)滴管及微量加樣器4)燒杯 (250mL 、 500m1) 、 量 筒 (

8、500mL 、250m1) 、 培 養(yǎng)皿 (15cml5cm)5) 注射器等四、實(shí)驗(yàn)操作1 裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來(lái)使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度 ,即可灌膠。2 凝膠的聚合分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10的分離膠和4.8 的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠5%的濃縮膠Acr/Bis 30%/ml3.30.8分離膠緩沖液（ pH8.9 ） /ml3.750濃縮膠緩沖液（ pH6.8 ）01.2510%SDS/ml0.10.110%過(guò)硫酸銨 /ul5025雙蒸水 /ml4.052.

9、92TEMED/ul55按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)面緩緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm 處為止 , 約 5mL。然后用細(xì)滴管或注射器仔細(xì)注入少量水, 約 0.5-1mL 。室溫放置聚合30-40min 。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長(zhǎng)滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子( 梳子 ) ；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。3 蛋白質(zhì)樣品的處理若標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取lmg 的樣品溶解于lmL 0.5mol L pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中；若樣品是液體，

10、要測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按 1.0 1.5mg mL溶液比例， 取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實(shí)驗(yàn)所用樣品為1520 g 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶液，放置在0.5mL 的離心管中，加入 15 20l 的樣品處理液。在 100 水浴中處理2min ，冷卻至室溫后備用。吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20l ，按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的處理方法進(jìn)行處理。4 加樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板 , 上提斜插板使其松開框 , 注意在上述過(guò)程中手始終給玻璃膠室一個(gè)夾緊力, 然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠, 再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽 , 插入斜板, 將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上3mm處即可

11、, 注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。, 外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿加樣時(shí)可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準(zhǔn)確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加10 15l( 含蛋白質(zhì)10 15g) ，稀溶液可加20 30l (還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握) 。5電泳加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進(jìn)膠前電流控制在 15 20mA，大約15 20min ；樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后，電流升到30 45mA，電泳過(guò)程保持電流穩(wěn)定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿1 2cm 處即停止電泳，約1-2 小時(shí)。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。6染色、脫色電泳結(jié)束后，關(guān)掉

12、電源，取出玻璃板，在長(zhǎng)短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動(dòng)，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25 的考馬斯亮藍(lán)染液，染色2 4h，必要時(shí)可過(guò)夜。棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進(jìn)行擴(kuò)散脫色，經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。7結(jié)果處理1)測(cè)量脫色后凝膠板的長(zhǎng)度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動(dòng)距離( 即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離 ) ，測(cè)量指示染料遷移的距離。2)按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率(Rm)相對(duì)遷移率樣品遷移距離(cm) 染料遷移距離(cm)3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上做圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。4) 測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得該蛋白質(zhì)的分子量。五、思考題1 聚丙烯酰胺盤狀凝膠電泳的幾個(gè)不連續(xù)性是什么？2 電泳時(shí)的三個(gè)物理效應(yīng)是什么？是怎樣造成的？3 電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？4 上樣緩沖液中加入甘油的作用是什么？5 貯液配制及貯存應(yīng)注意什么？6過(guò)硫酸銨、 7%乙酸和考馬斯亮藍(lán)在實(shí)驗(yàn)中有什么作用？附：不同分離膠的配制方