單個細胞分離技術(shù)PBMC

1、美麗的海醫(yī)校園美麗的海醫(yī)校園 臨床免疫學(xué)實驗指導(dǎo)臨床免疫學(xué)實驗指導(dǎo)海南醫(yī)學(xué)院海南醫(yī)學(xué)院實驗六實驗六 單個核細胞分離及細胞免疫功能檢測單個核細胞分離及細胞免疫功能檢測【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?.1.熟悉淋巴細胞分離方法熟悉淋巴細胞分離方法2.2.了解了解T T淋巴細胞亞群測定方法及其臨床意義淋巴細胞亞群測定方法及其臨床意義 T T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答特征：是細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答特征：是T T細胞輔助細胞（細胞輔助細胞（Th1Th1）介導(dǎo)的）介導(dǎo)的 單個核細胞（單個核細胞（L, ML, M），以浸潤為主的炎癥反應(yīng)與細胞毒性），以浸潤為主的炎癥反應(yīng)與細胞毒性T T細胞細胞 （CTLCTL或或TCTC）發(fā)生特

2、異性細胞毒效應(yīng)）發(fā)生特異性細胞毒效應(yīng). . 臨床上反復(fù)感染者和腫瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有臨床上反復(fù)感染者和腫瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 細胞免疫缺陷，必須進行細胞免疫缺陷的檢測，而這種檢查的細胞免疫缺陷，必須進行細胞免疫缺陷的檢測，而這種檢查的 第一步就是單個核細胞的分離，計數(shù)。然后進行功能檢查。第一步就是單個核細胞的分離，計數(shù)。然后進行功能檢查。 一、單個核細胞分離法（主要為淋巴細胞）一、單個核細胞分離法（主要為淋巴細胞）（一）葡聚糖（一）葡聚糖泛影葡胺法分離單個核細胞泛影葡胺法分離單個核細胞 密度梯度離心法：密度梯度離心法：水平離心機，逐漸加速，自然停轉(zhuǎn)水平離心機，逐

3、漸加速，自然停轉(zhuǎn)1.1.分離液：分離液：葡聚糖葡聚糖- -泛影葡胺混合液泛影葡胺混合液（比重（比重1.0751.0751.0921.092之間）之間） 將分離液將分離液，加入抗凝血中離心，離心后，加入抗凝血中離心，離心后不同比重的血細胞在分不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。離液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。紅細胞和多核白細胞比重較大（紅細胞和多核白細胞比重較大（1.0921.092），分布于最底層），分布于最底層，單核細胞比重較小（單核細胞比重較?。?.0751.0751.0901.090），分布于血漿與分離液的），分布于血漿與分離液的交界處。交界處。界

4、限清楚，層次分明。將該層細胞吸出，即為單個核界限清楚，層次分明。將該層細胞吸出，即為單個核細胞（主要為淋巴細胞）細胞（主要為淋巴細胞）血漿和血小板位于最上層。血小板在血漿中下部血漿和血小板位于最上層。血小板在血漿中下部 2. Hanks2. Hanks緩沖液：（緩沖液：（ pH 7.2-7.4,pH 7.2-7.4,無無CaCa、MgMg離子）離子） 3. 0.4%3. 0.4%臺盼藍染液臺盼藍染液梯度離心法分離提取單個核細胞稀釋血漿稀釋血漿內(nèi)含血小板內(nèi)含血小板分離液分離液粒細胞粒細胞紅細胞紅細胞用細長吸管慢慢插入白膜層，沿管壁周邊輕輕吸取單核細胞層于另一試管內(nèi)用細長吸管慢慢插入白膜層，沿管壁

5、周邊輕輕吸取單核細胞層于另一試管內(nèi) 加入加入PBSPBS洗液洗液3-4ml3-4ml，離心洗滌，離心洗滌2 2次，次，1500/r,10min. 1500/r,10min. 棄去上清，留約棄去上清，留約50l.50l.加加含有含有10%10%滅活小牛血清滅活小牛血清-PBS-PBS液液1.0ml1.0ml，混勻充池，鏡下計數(shù)。，混勻充池，鏡下計數(shù)。單個核細胞單個核細胞 2000rpm/ 20-30min 肝素抗凝血肝素抗凝血2ml +Hanks2ml +Hanks液液2ml2ml液稀釋液稀釋沿管壁緩慢加入沿管壁緩慢加入到含有到含有2ml2ml淋巴細胞分離液的試管中淋巴細胞分離液的試管中( (不

6、能破壞二者的液面不能破壞二者的液面）, ,2000r/min 2000r/min 離心離心20min20min 吸出淋巴細胞層加入另一試管中，加吸出淋巴細胞層加入另一試管中，加3 34ml Hanks4ml Hanks液，混勻離心洗滌，液，混勻離心洗滌， 1500r/min 1500r/min 離心離心10min10min 棄棄去上清，去上清，再再加加3ml Hanks3ml Hanks液，混勻，液，混勻， 1500r/min 1500r/min 10min10min，重復(fù)洗滌，重復(fù)洗滌2 2次次 重復(fù)重復(fù)1 1次次 末次離心后，棄去上清液。加含末次離心后，棄去上清液。加含10%10%滅活小牛

7、血清滅活小牛血清/HanKs/HanKs液液 加至加至1.0ml1.0ml，混勻，灌入血細胞計數(shù)池，單個核細胞計數(shù)，混勻，灌入血細胞計數(shù)池，單個核細胞計數(shù)， 于低倍鏡下計數(shù)于低倍鏡下計數(shù)4 4個角大格內(nèi)細胞總數(shù)。個角大格內(nèi)細胞總數(shù)。 方法方法留取約留取約50l,加緩沖液至加緩沖液至1.0ml，稀釋，稀釋20倍倍計數(shù)細胞方法計數(shù)細胞方法 加樣：加樣：將淋巴細胞懸液混勻，吸取將淋巴細胞懸液混勻，吸取10l10l加入到加入到 40l40l含含10%10%滅活小牛滅活小牛血清的血清的HanksHanks液中，混勻后再吸取液中，混勻后再吸取10l10l充入計數(shù)板上。充入計數(shù)板上。細胞懸液稀釋細胞懸液稀釋

8、5 5倍。此稀釋也可省略，可根據(jù)細胞密度而定倍。此稀釋也可省略，可根據(jù)細胞密度而定靜置片刻，置顯微鏡下計算淋巴細胞數(shù)。靜置片刻，置顯微鏡下計算淋巴細胞數(shù)。具體計數(shù)方法如下：具體計數(shù)方法如下： 血細胞計數(shù)池的構(gòu)造血細胞計數(shù)池的構(gòu)造1.1.大方格大方格 9 9個個2.2.中方格分中方格分2 2種種WBCWBC計數(shù)區(qū)分計數(shù)區(qū)分1616個個RBCRBC計數(shù)區(qū)分計數(shù)區(qū)分2525個個3.3.小方格小方格1 1種，種， 是指是指RBCRBC計數(shù)區(qū)計數(shù)區(qū)的的1 1個中方格又分個中方格又分1616個小方格，即：個小方格，即：計數(shù)池內(nèi)有：計數(shù)池內(nèi)有：1 1種種大方格；大方格；2 2種中方種中方格；格；1 1種小方

9、格種小方格池深池深 0.1mm0.1mm 血細胞計數(shù)池的構(gòu)造參數(shù)血細胞計數(shù)池的構(gòu)造參數(shù) 4種方格的體積（容積）種方格的體積（容積） 計數(shù)池區(qū)域計數(shù)池區(qū)域 邊長（邊長（mmmm） 面積（面積（mm2mm2） 池深（池深（mmmm） 體積（體積（mm3 ulmm3 ul） 一個計數(shù)全池一個計數(shù)全池 3 9 0.10 0.903 9 0.10 0.90 大方格大方格 1 1 0.10 0.101 1 0.10 0.10 白細胞中方格白細胞中方格 0.25 0.0625 0.10 0.006250.25 0.0625 0.10 0.00625 紅細胞中方格紅細胞中方格 0.20 0.0400 0.10

10、 0.004000.20 0.0400 0.10 0.00400 紅細胞小方格紅細胞小方格 0.05 0.0025 0.10 0.000250.05 0.0025 0.10 0.00025細胞計數(shù)原則細胞計數(shù)原則 計左上，不計右下計左上，不計右下 血細胞計數(shù)板血細胞計數(shù)板血細胞計數(shù)板上四個角的血細胞計數(shù)板上四個角的四個大方格四個大方格1 1個大方格中個大方格中1616個中方格個中方格 計數(shù)血細胞計數(shù)板上四個角的計數(shù)血細胞計數(shù)板上四個角的 四個大方格內(nèi)單個核細胞總數(shù)。四個大方格內(nèi)單個核細胞總數(shù)。（只計算上邊和左邊的壓線細胞，（只計算上邊和左邊的壓線細胞， 右邊和下邊壓線細胞不計算）右邊和下邊壓線

11、細胞不計算） 單個核細胞總數(shù)計算：單個核細胞總數(shù)計算： 是指最終制備的每是指最終制備的每mlml細胞緩沖液內(nèi)的細胞緩沖液內(nèi)的 單個核細胞的密度（數(shù)量）單個核細胞的密度（數(shù)量）單個核細胞總數(shù)單個核細胞總數(shù)/ml/ml= = 單個核細胞總數(shù)單個核細胞總數(shù)/ml = X/4/ml = X/41010( (稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)) ) 10103 3=X=X10104 44 4 4個大方格內(nèi)個大方格內(nèi) 細胞總數(shù)細胞總數(shù) 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 10104 4關(guān)于稀釋倍數(shù)：這里不是指血液稀釋倍數(shù)。是指最后洗滌關(guān)于稀釋倍數(shù)：這里不是指血液稀釋倍數(shù)。是指最后洗滌離心棄去上清液后的單個核細胞沉淀中，加入緩沖液離心棄去上清

12、液后的單個核細胞沉淀中，加入緩沖液1.0ml后。后。 此緩沖液中的單個核細胞密度。此緩沖液中的單個核細胞密度。細胞存活率檢測細胞存活率檢測 取取10l10l淋巴細胞懸液加入淋巴細胞懸液加入0.4%0.4%臺盼藍染色液臺盼藍染色液10l10l， 混勻。取混勻。取10l10l加入血細胞計數(shù)板，靜置片刻，加入血細胞計數(shù)板，靜置片刻， 置顯微鏡高倍鏡下觀察。計數(shù)置顯微鏡高倍鏡下觀察。計數(shù)200200個單個核細胞個單個核細胞 分別記錄活細胞數(shù)，死細胞數(shù)，帶入計算公式，分別記錄活細胞數(shù)，死細胞數(shù)，帶入計算公式， 報告活細胞存活率。報告活細胞存活率?！窘Y(jié)果判定【結(jié)果判定】 活細胞不著色，折光性強?；罴毎恢?/p>

13、色，折光性強。死細胞由于染料可滲入死細胞由于染料可滲入 細胞內(nèi)，細胞內(nèi)，故死細胞被染成藍色，故死細胞被染成藍色，體積較大，無光澤體積較大，無光澤 正常情況下，活細胞存活率應(yīng)在正常情況下，活細胞存活率應(yīng)在95%95%以上。以上。 表明免疫活性細胞數(shù)量正常。然后做其他功能檢測表明免疫活性細胞數(shù)量正常。然后做其他功能檢測 在高倍鏡下計數(shù)在高倍鏡下計數(shù)200200個細胞中的死亡細胞數(shù)，個細胞中的死亡細胞數(shù)， 計算其存活率：使用血細胞計數(shù)器：計算其存活率：使用血細胞計數(shù)器： 細胞存活率細胞存活率 =活細胞數(shù)活細胞數(shù)(N)(N) 活細胞數(shù)活細胞數(shù)+ +死細胞數(shù)死細胞數(shù) 200200 100% 100% 例

14、如：活細胞總數(shù)為例如：活細胞總數(shù)為 120120個，存活率為：個，存活率為：60%60%； 若活細胞計數(shù)為若活細胞計數(shù)為180180個，存活率：個，存活率：90%90%【臨床意義臨床意義】 分離單個淋巴細胞技術(shù)是進行細胞免疫試驗的重要技術(shù)之一，分離單個淋巴細胞技術(shù)是進行細胞免疫試驗的重要技術(shù)之一，是進行流式細胞分析技術(shù)的重要的前期基本操作；是進行流式細胞分析技術(shù)的重要的前期基本操作； 是進行各項免疫細胞功能檢測的基礎(chǔ)技術(shù)。是進行各項免疫細胞功能檢測的基礎(chǔ)技術(shù)。 分離所得的單個核細胞可滿足許多實驗需要，分離所得的單個核細胞可滿足許多實驗需要， 不僅用于淋巴細胞總數(shù)和細胞的存活率測定，不僅用于淋巴

15、細胞總數(shù)和細胞的存活率測定， 也用于進一步純化淋巴細胞，進行淋巴細胞分類，分群，也用于進一步純化淋巴細胞，進行淋巴細胞分類，分群， 表面抗原，各種標志物以及其他淋巴細胞功能測定等。表面抗原，各種標志物以及其他淋巴細胞功能測定等。 實驗報告：實驗報告：1.1. 報告單個核細胞計數(shù)總數(shù)結(jié)果報告單個核細胞計數(shù)總數(shù)結(jié)果2.2. 報告單個核細胞存活率報告單個核細胞存活率3. 3. 簡述密度梯度離心法分離單個核細胞的原理簡述密度梯度離心法分離單個核細胞的原理4. 4. 分離單個淋巴細胞的臨床意義分離單個淋巴細胞的臨床意義T T細胞總數(shù)測定：細胞總數(shù)測定：EtEt花環(huán)實驗。學(xué)生課余自學(xué)內(nèi)容?；ōh(huán)實驗。學(xué)生課余自學(xué)內(nèi)容。E+E+淋巴細胞百分率測定：正常人參考值：淋巴細胞百分率測定：正常人參考值： 60%-80%60%-80%由于干擾因素較多，主觀因素影響，臨床意義不明顯由于干擾因素較多，主觀因素影響，臨床意義不明顯結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性不高等原因，很少做。結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性不高等原因，很少做。T T細胞總數(shù)測定細胞總數(shù)測定EtEt花環(huán)沉降法花環(huán)沉降法（E+E+淋巴細胞百分率：淋巴細胞百分率：60-80%60-80%）人類人類T