酶與蛋白質(zhì)工程第9章固定化酶與固定化細(xì)胞

1、第九講第九講 固定化酶與固定化細(xì)胞固定化酶與固定化細(xì)胞固定化酶固定化酶(Immobilized Enzyme） 20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù) 以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性酶。這些水溶性酶催化結(jié)束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展 60年代后，在酶學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)涌現(xiàn)出固定化酶。通過(guò)物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚甘`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動(dòng)，但能使酶充分發(fā)揮催化作用 曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國(guó)際酶工程會(huì)上正式建議采用固定化酶的名稱 從60年代起，固定化酶的研究發(fā)展很快，起初人們把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近來(lái)，不但固定化方法

2、和載體開(kāi)發(fā)有了長(zhǎng)足發(fā)展，并且已轉(zhuǎn)向它在工業(yè)、醫(yī)藥、化學(xué)分析、親和層析、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)以及理論研究等方面的應(yīng)用研究 固定化酶固定化酶固定化酶與水溶性酶比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：固定化酶與水溶性酶比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 極易將固定化酶極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，；產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝簡(jiǎn)化了提純工藝(2) 可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化，有利于工藝的連續(xù)化、管道化(3) 酶反應(yīng)過(guò)程可以酶反應(yīng)過(guò)程可以嚴(yán)格控制嚴(yán)格控制，有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化，有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化(4) 在絕大多數(shù)情況下在

3、絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性提高了酶的穩(wěn)定性(5) 較能較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)適應(yīng)于多酶反應(yīng)(6) 酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低成本低 固定化酶固定化酶 固定化酶也存在一些缺點(diǎn)：固定化酶也存在一些缺點(diǎn)：(1) 酶固定化時(shí)酶的酶固定化時(shí)酶的活力有所損失活力有所損失。同時(shí)也增加了。同時(shí)也增加了固定化的成本固定化的成本，使工廠開(kāi)始投資大使工廠開(kāi)始投資大(2) 比較適應(yīng)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物水溶性底物和小分子底物(3) 與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)。與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子

4、的反應(yīng)。同時(shí)，對(duì)同時(shí)，對(duì)胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后才能固定化胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后才能固定化 固定化酶固定化酶酶的固定化方法酶的固定化方法吸附法吸附法；共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法；交聯(lián)法交聯(lián)法；包埋法包埋法 固定化酶固定化酶吸附法吸附法吸附法分為吸附法分為物理吸附法物理吸附法和和離子交換吸附法離子交換吸附法 物理吸附法物理吸附法: 通過(guò)氫鍵、疏水作用和通過(guò)氫鍵、疏水作用和電子親和力等物理作電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上，制成固定化酶用，將酶固定于水不溶載體上，制成固定化酶 有機(jī)載體，纖維素、骨膠原、淀粉等 如，用纖維素作為吸附劑吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶。吸附后在載體表面形成單

5、分子層，吸附蛋白能力約70 mg/cm2無(wú)機(jī)載體，氧化鉛、高嶺土、多孔硅、多孔玻璃等 如，用多孔硅為載體吸附淀粉酶，在45進(jìn)行固定化，用高濃度底物 進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。無(wú)機(jī)載體的吸附容量較低、而且酶容易脫落 固定化酶固定化酶(2)離子交換吸附法離子交換吸附法: 將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法合而達(dá)到固定化的一種方法 酶吸附較牢，在工業(yè)上具廣泛用途酶吸附較牢，在工業(yè)上具廣泛用途常用載體：陰離子交換劑，二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類（ECTEDLA）-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠陽(yáng)離子交換劑

6、，羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽 固定化酶固定化酶 通過(guò)通過(guò)酶蛋白化學(xué)修飾增加蛋白質(zhì)分子上電荷酶蛋白化學(xué)修飾增加蛋白質(zhì)分子上電荷，能有效的，能有效的克服吸附法制備的固定化酶在使用過(guò)程的解吸克服吸附法制備的固定化酶在使用過(guò)程的解吸如，用乙烯-順丁烯二酸酐共聚物共價(jià)修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用DEAE-纖維素載體有效固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附此外，酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中此外，酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度、pH、溫度溫度、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度濃度及及酶和載體的特性酶和載體的特性相關(guān)相關(guān) pHpH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對(duì)酶的吸附。在等電點(diǎn)兩側(cè)(1-2p

7、H單位)吸附將明顯減少 鹽可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸附，即所謂鹽析吸附 對(duì)蛋白質(zhì)吸附來(lái)說(shuō)，隨溫度的升高吸附下降 載體的表面積、多孔性及其預(yù)處理都影響對(duì)酶的吸附 固定化酶固定化酶 吸附法制備固定化酶吸附法制備固定化酶操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單，可充分選擇不同電荷、不同，可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，形狀的載體，吸附過(guò)程可以同時(shí)純化酶吸附過(guò)程可以同時(shí)純化酶，固定化酶在使用過(guò)程失，固定化酶在使用過(guò)程失活后可重新活化，同時(shí)，載體可以活后可重新活化，同時(shí)，載體可以回收再利用回收再利用 但由于有些機(jī)理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化但由于有些機(jī)理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關(guān)系酶活力回收的

8、關(guān)系不可預(yù)見(jiàn)性大不可預(yù)見(jiàn)性大，同時(shí)由于吸附法制備的固定化，同時(shí)由于吸附法制備的固定化酶酶易脫落易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性 固定化酶固定化酶交聯(lián)法交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑，在利用雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶與載體間進(jìn)酶分子間或酶與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的方法，以制備固定化酶的方法最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，用戊二醛交聯(lián)制備固定化酶的反應(yīng)如下： 固定化酶固定化酶交聯(lián)方法：交聯(lián)方法： (1) 交聯(lián)酶法交聯(lián)酶法 在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶中，生

9、成不溶性固定化酶 如：木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白濃度、2.3戊二醛、pH 5.2-7.2、0 下 交聯(lián)24h，可形成固定化酶 這種方法也用于這種方法也用于制備交聯(lián)的結(jié)晶酶制備交聯(lián)的結(jié)晶酶。交聯(lián)結(jié)晶酶仍具有一定。交聯(lián)結(jié)晶酶仍具有一定酶活力酶活力如：將500mg酶溶于5m1 0.2mol/L 醋酸緩沖液中，在攪拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室溫下放置10-30min，會(huì)有沉淀析出，1-3h內(nèi)反應(yīng)結(jié)束。形成的凝膠切碎后水洗，除多余戊二醛，即為固定化酶 固定化酶固定化酶(2) 載體交聯(lián)法載體交聯(lián)法 用多或雙功能試劑的用多或雙功能試劑的一部分功能基團(tuán)與載體交聯(lián)一部分功能基團(tuán)與載體交聯(lián)，另一部分功另一部分

10、功能基團(tuán)與酶蛋白交聯(lián)能基團(tuán)與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法而制備固定化酶的方法 單用戊二醛等試劑交聯(lián)制備的固定化酶活力較低，單用戊二醛等試劑交聯(lián)制備的固定化酶活力較低，常將常將此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用，可以達(dá)到既提高固定化酶，可以達(dá)到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果的活力，又起到加固的效果 固定化酶固定化酶共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法 酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面功能基團(tuán)之間酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵形成共價(jià)鍵而固定的方法而固定的方法其優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落，但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時(shí)，制作手續(xù)亦較繁瑣酶分子和載體連接的功能基團(tuán)酶

11、分子和載體連接的功能基團(tuán) 從理論上講，酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種： 酶蛋白N-N-端的氨基或賴氨酸殘基氨基 酶蛋白C-C-端的羧基以及AspAsp殘基和GluGlu殘基的羧基 CysCys殘基的巰基 SerSer、TyrTyr、ThrThr殘基的羥基 PhePhe和TyrTyr殘基的苯環(huán) HisHis殘基的咪唑基 TrpTrp殘基的吲哚基 固定化酶固定化酶在實(shí)際中偶聯(lián)最普遍的基團(tuán)是：氨基、羧基以及苯環(huán)。被偶聯(lián)的基團(tuán)還應(yīng)是酶活性的非必需基團(tuán)，否則將導(dǎo)致酶失去活性(2) 載體的選擇載體的選擇 載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對(duì)載體的一般要求是:一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶

12、活力及其穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度載體必須有在溫和條件與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)載體沒(méi)有或很少有非專一性吸附載體來(lái)源容易，并能反復(fù)使用(3) 偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)反應(yīng) 酶和載體的連接反應(yīng)取決于載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)，而且是在十分溫和的pH、中等離子強(qiáng)度和較低溫的緩沖液中進(jìn)行現(xiàn)已有多種偶聯(lián)反應(yīng)能制備固定化酶。這些方法在實(shí)際運(yùn)用中經(jīng)濟(jì)意義起著決定作用，必須考慮到酶的偶聯(lián)效率，固定化酶總活力，操作的簡(jiǎn)便性以及載體與試劑的成本等因素 固定化酶固定化酶如，如，重氮法重氮法 將將帶芳香族氨基的載體帶芳香族氨基的載體，先用，先用NaNO2和稀鹽酸處理和稀鹽酸處理成

13、成重氮鹽衍生物重氮鹽衍生物，再在中性偏堿，再在中性偏堿(pH 8-9)條件下條件下與酶蛋白發(fā)生偶與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶，得到固定化酶 固定化酶固定化酶含醛基高聚物、多糖類含醛基高聚物、多糖類，如淀粉、葡聚糖、纖維素等用高碘酸，如淀粉、葡聚糖、纖維素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，形成含醛基或二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，形成含醛基( (每一葡萄糖產(chǎn)生兩每一葡萄糖產(chǎn)生兩個(gè)醛基個(gè)醛基) )高聚物，可與酶蛋白氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶高聚物，可與酶蛋白氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶 固定化酶固定化酶例如：用甘蔗渣纖維素衍生物固定化木瓜蛋白酶例如：用甘蔗渣纖維素衍生物固定化木瓜蛋白酶載體制備：

14、60g甘蔗渣纖維素浸于500ml 0.6 NaOH溶液中85處理30min，水洗至中性，抽干。懸浮于NaI04溶液中，空溫下攪拌12h，用水反復(fù)沖洗、抽干。置于IL尿素溶液中，攪拌。產(chǎn)物用水反復(fù)洗滌，抽干后，置于12甲醛溶液中攪拌處理12h，用水洗滌，除去過(guò)量甲醛加酶固定: 上述載體1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸緩沖液配制)攪拌下4-8固定18h，用pH7.2 0.1mol/L磷酸緩沖液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即為固定化酶包埋法包埋法 將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑(

15、(包括交包括交聯(lián)劑聯(lián)劑) )的作用進(jìn)行聚合，的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化包埋法操作簡(jiǎn)單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶。對(duì)大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都適用但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對(duì)大分子底物不適宜。同時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的變化、活力降低 包埋法常用包埋法常用凝膠包埋法凝膠包埋法和和微囊化法微囊化法 固定化酶固定化酶(1)(1)凝膠包埋法凝膠包埋法 將酶分子包埋在凝膠格子中將酶分子包埋在凝膠格子中 聚丙烯酰胺凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法一般的制備過(guò)程如

16、下：將1ml溶于適當(dāng)緩沖液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(單體)和40mgN，N-甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速劑)，同時(shí)，加入1過(guò)硫酸銨(引發(fā)劑)，混合，于室溫保溫10min，便得含酶凝膠。將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒，于低溫儲(chǔ)存或冷凍干燥。為制得珠狀固定化酶，可以在聚合反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，立即轉(zhuǎn)入到疏水相(一種乳化劑，與水相有相同密度)的有機(jī)溶液中，使分散成含酶的珠狀凝膠 聚丙烯酰胺包埋法的缺點(diǎn)：聚丙烯酰胺包埋法的缺點(diǎn)：酶容易漏失酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)，以低分子量蛋白質(zhì)為甚，如果為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服

17、與交聯(lián)程度可以得到克服 固定化酶固定化酶 輻射包埋法輻射包埋法酶溶于純單體水溶液、單體加合物水溶液或純聚合物溶液中，在常溫或低溫下，用X-射線、Y-射線或電子束輻照，可得到包埋酶的親水凝膠如，用X-射線引發(fā)丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶1973年HMaeda等用聚乙烯水溶液輻照包埋了多種酶運(yùn)用弱水性或稍具疏水性的玻璃化載體，用低溫過(guò)冷態(tài)的輻照聚合，可用于一般生物物質(zhì)的固定化，這些生物物質(zhì)主要分布在載體表面層區(qū)域，固定化產(chǎn)物表面具有生物活性，長(zhǎng)期使用后仍有較高的活性 固定化酶固定化酶 (2) 微囊化法微囊化法 將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi) 酶存在于類似

18、細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性 小分子底物能通過(guò)膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)散而輸出 微囊一般直徑約1100um，膜厚約100nm，膜上孔徑約3.6nm，表面積與體積之比極大，物質(zhì)能很快達(dá)到平衡 可用不同類型、不同濃度的酶、細(xì)胞提取物或細(xì)胞，不同組成和含量的膜包裹組建成人工細(xì)胞因此，此法在醫(yī)療上應(yīng)用極為廣泛。例如，固定化天門冬酰胺酶(治療白血病)就是用這種方法制成的微膠囊 固定化酶固定化酶 界面沉淀法界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成膜，從而將酶包埋的方法 界面聚合法界面聚合法 將疏水性和親水性單體在界面進(jìn)行聚合形成半透膜，

19、使酶包埋于半透膜微囊中 固定化酶固定化酶微膠囊的制備方法微膠囊的制備方法 紅血球包埋法紅血球包埋法 在高滲溶液中紅細(xì)胞膨脹伸展后，細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白漏出，同時(shí)胞外蛋白也能擴(kuò)散進(jìn)紅血球，再放進(jìn)等滲溶液中，紅血球膜又回復(fù)至正常狀態(tài)和透性，進(jìn)入的酶不會(huì)漏出 脂質(zhì)體包埋法脂質(zhì)體包埋法 采用雙層脂質(zhì)體形成極細(xì)球粒包埋酶固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力固定化酶活力 與溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有： 酶與不溶性載體相結(jié)合引起結(jié)構(gòu)變化； 酶活性中心重要氨基酸殘基與載體相結(jié)合； 載體與酶結(jié)合后，酶雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻，從而使活力下降 在包埋法中，酶

20、活性的下降可能是在酶的固定過(guò)程中有變性所致活力回收和相對(duì)活力活力回收和相對(duì)活力 酶固定化一般比溶液酶的活力下降，酶固定化一般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力固定化酶活力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)的百分?jǐn)?shù)稱為活力回收稱為活力回收 固定化酶固定化酶固定化酶活力測(cè)定固定化酶活力測(cè)定 基本上基本上與溶液酶相似與溶液酶相似，也以反應(yīng)初速度表示。即每毫克干重，也以反應(yīng)初速度表示。即每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1 1molmol底物量或形成底物量或形成1 1molmol產(chǎn)物的酶量為一個(gè)產(chǎn)物的酶量為一個(gè)單位單位(mol/mgmin)(mol/mgmin)，對(duì)于酶管、酶膜、酶板等，則以單

21、位面積，對(duì)于酶管、酶膜、酶板等，則以單位面積（cmcm2 2）的初速度來(lái)表示）的初速度來(lái)表示 固定化酶固定化酶固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的穩(wěn)定性 大多數(shù)酶在固定化后都不同程度大多數(shù)酶在固定化后都不同程度提高了穩(wěn)定性提高了穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了有效，延長(zhǎng)了有效壽命壽命 固定化增加酶構(gòu)象的牢固程度 阻擋不利因素對(duì)酶的侵襲 限制了酶分子間的相互作用但如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降但如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性 大多數(shù)酶在固定化后與溶液酶相比，有大多數(shù)酶在固定化后與溶液酶相比，有較高熱穩(wěn)定性較高熱穩(wěn)定性，這種性這種性質(zhì)對(duì)質(zhì)對(duì)工業(yè)上的應(yīng)用有益工業(yè)上

22、的應(yīng)用有益如，氨基?；福芤好冈?5保溫15min，活力為0；DEAE-Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80；DEAE-纖維素固定化酶在同樣條件下還有60活力。CM-纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高5-15其他，如固定化乳酸脫氫酶、脲酶等都比溶液酶的熱穩(wěn)定性提高 固定化酶固定化酶pH-酶活力關(guān)系酶活力關(guān)系 反應(yīng)的最適反應(yīng)的最適pH和和pH-酶活力曲線的變動(dòng)酶活力曲線的變動(dòng)依據(jù)酶蛋白和載體的電依據(jù)酶蛋白和載體的電荷而定荷而定。帶負(fù)電荷的載體，往往導(dǎo)致固定化酶的最適。帶負(fù)電荷的載體，往往導(dǎo)致固定化酶的最適pH向堿性方向向堿性方向移動(dòng)；帶正電荷的載體則相反移動(dòng)；帶正電荷的

23、載體則相反 盡管大多數(shù)固定化酶的活力盡管大多數(shù)固定化酶的活力-pH關(guān)系曲線仍為鐘形曲線，但與溶關(guān)系曲線仍為鐘形曲線，但與溶液酶比較，其鐘形更陡，或更坦，向酸性或堿性方向偏移液酶比較，其鐘形更陡，或更坦，向酸性或堿性方向偏移對(duì)蛋白酶的抵抗能力對(duì)蛋白酶的抵抗能力 溶液酶經(jīng)固定化后溶液酶經(jīng)固定化后提高了對(duì)蛋白酶的抵抗能力提高了對(duì)蛋白酶的抵抗能力 如：氨基?；冈谝鹊鞍酌缸饔孟禄盍H存20，而將其固定于DEAE-纖維素上在同樣條件下仍有80的活力可能是因?yàn)榈鞍酌阜肿恿看?，受到空間位阻，不能進(jìn)入固定化酶中可能是因?yàn)榈鞍酌阜肿恿看螅艿娇臻g位阻，不能進(jìn)入固定化酶中 固定化酶固定化酶對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗能

24、力對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗能力 酶經(jīng)固定化后，酶經(jīng)固定化后，提高了對(duì)蛋白質(zhì)變性劑和抑制劑的抵抗能力提高了對(duì)蛋白質(zhì)變性劑和抑制劑的抵抗能力如，氨基?；概c固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比較，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分別為9、49、1和55，而后者在相應(yīng)溶液中活力則分別為146、117、35和138操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性 固定化酶在固定化酶在操作中可以長(zhǎng)期使用操作中可以長(zhǎng)期使用，半衰期（，半衰期（t1/2，即酶活性，即酶活性達(dá)到原有酶活性一半時(shí)所需的時(shí)間）較長(zhǎng)達(dá)到原有酶活性一半時(shí)所需的時(shí)間）較長(zhǎng)貯藏穩(wěn)定性貯藏穩(wěn)定性 大多數(shù)酶經(jīng)固定化后大多數(shù)酶經(jīng)固定化

25、后提高了貯藏的穩(wěn)定性提高了貯藏的穩(wěn)定性，如固定化木瓜蛋，如固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在白酶（瓊脂）在4下，下，120天酶活力無(wú)變化天酶活力無(wú)變化 固定化酶固定化酶固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 固定化細(xì)胞是在固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的發(fā)展起來(lái)的優(yōu)點(diǎn):(1)省去了酶的分離程序(2)細(xì)胞生長(zhǎng)快、多、反應(yīng)快(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對(duì)污染因子抵抗力增加 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞缺點(diǎn)：(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度(

26、2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成(3)細(xì)胞膜、壁會(huì)阻礙底物滲透和擴(kuò)散微生物細(xì)胞的固定化方法微生物細(xì)胞的固定化方法 菌體細(xì)胞的固定化方法菌體細(xì)胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包，主要有包埋法、吸附法等埋法、吸附法等 包埋法包埋法 包埋法是包埋法是制備固定化細(xì)胞最常用的方法制備固定化細(xì)胞最常用的方法 將產(chǎn)酶菌株用包埋劑，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來(lái)，發(fā)揮酶或酶系的作用 如，1977年我國(guó)投入生產(chǎn)的固定化青霉素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿茵而成 美國(guó)、歐洲和日本等大

27、規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿的工藝多數(shù)采用固定化菌體的酶柱工藝 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞(2) 吸附法吸附法 分物理吸附法和離子交換吸附法分物理吸附法和離子交換吸附法 物理吸附法物理吸附法 物理吸附法是將微生物細(xì)胞附著于固體載體上的一種固定方法。載體常用的多孔磚、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纖維等如，將酵母用聚氯乙烯或多孔磚固定化，每克載體可以固定80mg酵母；也可將固定化的釀酒酵母，裝入反應(yīng)柱，以生產(chǎn)乙醇，乙醇可達(dá)120g/L。在環(huán)境保護(hù)中用木片、石礫等固定微生物細(xì)胞作為污水處理的過(guò)濾器物理吸附法載體物理吸附法載體與微生物細(xì)胞間不起反應(yīng)與微生物細(xì)胞間不起反應(yīng)，吸附量大吸附量

28、大，但細(xì)胞，但細(xì)胞極極容易脫落而流失容易脫落而流失 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞離子交換吸附法離子交換吸附法 利用離子交換吸附細(xì)胞常用的載體是離子交換樹脂例如，利用陰離子交換樹脂吸附放線菌含葡萄糖異構(gòu)酶含酶菌株；用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用離子交換纖維素吸附無(wú)色桿菌(含頭孢霉素酰化酶菌株)；用離子交換纖維素吸附米曲霉含轉(zhuǎn)化酶菌株等獲得成功這種方法制備的固定化細(xì)胞，細(xì)胞這種方法制備的固定化細(xì)胞，細(xì)胞易脫落易脫落，需不斷補(bǔ)充新細(xì)胞，需不斷補(bǔ)充新細(xì)胞 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞動(dòng)植物細(xì)胞固定化動(dòng)植物細(xì)胞固定化植物細(xì)胞固定化植物細(xì)胞固定化 植物細(xì)胞比菌體細(xì)胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。植物細(xì)胞比

29、菌體細(xì)胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代開(kāi)始研究，目前一般采用年代開(kāi)始研究，目前一般采用包埋法包埋法和和吸附法吸附法 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞包埋法包埋法 將植物細(xì)胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中 Brodelius等(1979)首次用海藻酸鈣包埋制備了固定化長(zhǎng)春花細(xì)胞、毛地黃細(xì)胞、海巴戟細(xì)胞在在Ca2+離子等多價(jià)陽(yáng)離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和陽(yáng)離子離子等多價(jià)陽(yáng)離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和陽(yáng)離子之間形成之間形成離子鍵離子鍵。因。因海藻酸鈣不溶于水，在細(xì)胞表面形成凝膠海藻酸鈣不溶于水，在細(xì)胞表面形成凝膠如果采用磷酸、檸檬酸、如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等等

30、螯合劑處理將螯合劑處理將Ca2+離子除去離子除去，又能使又能使膠體溶解釋放出細(xì)胞膠體溶解釋放出細(xì)胞當(dāng)海藻酸鈣微囊用當(dāng)海藻酸鈣微囊用多聚賴氨酸處理多聚賴氨酸處理后，使凝膠微球后，使凝膠微球表面成膜表面成膜，不會(huì)再被螯合劑溶解。不會(huì)再被螯合劑溶解。再用檸檬酸去除鈣離子再用檸檬酸去除鈣離子，球內(nèi)海藻酸鈉，球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài)，成液態(tài)，細(xì)胞懸浮在微囊內(nèi)細(xì)胞懸浮在微囊內(nèi)海藻酸鹽海藻酸鹽多聚賴氨酸微囊化多聚賴氨酸微囊化 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞植物細(xì)胞微囊化示意圖 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞吸附法吸附法 將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi),或吸附于中空纖維外壁上 如,將植物細(xì)胞定置在中空纖維的外壁與容器內(nèi)壁之間，

31、培養(yǎng)液及O2在中空維管內(nèi)流動(dòng)，透過(guò)中空纖維管壁(具半透膜性)，傳遞給附著于外壁的細(xì)胞，細(xì)胞代謝產(chǎn)物亦透過(guò)外壁隨管內(nèi)培養(yǎng)液流出。利用此法固定的豌豆細(xì)胞和胡蘿卜細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)多酚化合物的研究，可連續(xù)使用1個(gè)多月 如,將洗凈、滅茵后的泡沫塑料放進(jìn)辣椒細(xì)胞培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一 段時(shí)間，細(xì)胞吸附于塑料孔洞內(nèi)，并能生長(zhǎng)繁殖 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞固定化動(dòng)物細(xì)胞固定化 動(dòng)物細(xì)胞比菌體細(xì)胞、植物細(xì)胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化動(dòng)物細(xì)胞比菌體細(xì)胞、植物細(xì)胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化方法。目前，動(dòng)物細(xì)胞固定的方法有方法。目前，動(dòng)物細(xì)胞固定的方法有吸附法吸附法和和包埋法包埋法兩種，其中吸兩種，其中吸附法用的最多附

32、法用的最多吸附法吸附法 由于由于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中趨向于附著固體，在培養(yǎng)過(guò)程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動(dòng)物細(xì)胞表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動(dòng)物細(xì)胞主要載體及固定方法有：主要載體及固定方法有：(1) 轉(zhuǎn)瓶法轉(zhuǎn)瓶法 轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成。其表面經(jīng)一定處理而帶有電荷，如用高錳酸鉀等氧化劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或紫外輻射等表而處理，可使動(dòng)物細(xì)胞附著于表面，轉(zhuǎn)瓶以一定旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)行培養(yǎng).若在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)增大表面積，可提高生產(chǎn)能力 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞(2) 微載體法微載體法 微載體是指直徑為100-200um，相對(duì)密度接近于1.0的顆

33、粒固定化載體。由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微載體具有較大的表面，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)傳遞特別有利，但強(qiáng)度不夠易破碎，使用時(shí)間較短，已用于固定多種細(xì)胞。如用于生產(chǎn)干擾素、人纖溶酶原活化劑白細(xì)胞介素及各種疫苗的細(xì)胞固定化 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞(3)中空纖維法中空纖維法 中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。將細(xì)胞胞置于管外壁扣容器外殼之間，則細(xì)胞附著于外壁上，培養(yǎng)液從管內(nèi)流動(dòng)，能透過(guò)管壁進(jìn)行質(zhì)熱傳遞，中空纖維起著體內(nèi)微血管的作用，有利細(xì)胞生長(zhǎng)及其新陳代謝。已有多種中空纖維固定化細(xì)胞用于生產(chǎn)各種單克降抗體和疫苗微載體培養(yǎng)微載

34、體培養(yǎng) 1967年，維爾茨（van Wezel）開(kāi)發(fā)了微載體系統(tǒng) 微載體系統(tǒng)將傳統(tǒng)的一維平面一維平面貼附擴(kuò)展為三維立體三維立體貼附，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）的限制 微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能滿足能滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求，又能充分利用生物反應(yīng)器內(nèi)部空間充分利用生物反應(yīng)器內(nèi)部空間 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞微載體制作方法微載體制作方法制作方法包括：高溫?zé)Y(jié)法、聚合物快速凝聚法、高分子材料成球聚合法、 銳孔噴液冷凍凝固法 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞1)1)選擇合適的微載體類型選擇合適的微載體類型 對(duì)細(xì)胞在不同微載體上的貼附性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算細(xì)胞貼壁率和細(xì)胞數(shù),并繪制

35、成曲線,比較細(xì)胞容納量、微載體用量、攪拌速度,由此選出適當(dāng)?shù)奈⑤d體2)2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒 在玻璃容器內(nèi)加入適量的微載體, 加入無(wú)Ca2+、Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)浸泡3h以上,輕輕攪動(dòng)。然后加入1/2的新鮮PBS再洗1次。高壓蒸汽滅菌3)3)接種接種 根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度。微載體的濃度一般按2-3g/L配制,攪拌速度控制在50-70 r/min微載體培養(yǎng)基本流程微載體培養(yǎng)基本流程 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞4)4)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù) 在顯微鏡下直接觀察微載體上細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，將微載體上的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度5)5)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 微載體上分離后的細(xì)胞

36、可進(jìn)一步做微載體傳代培養(yǎng)。如果放大培養(yǎng),可在細(xì)胞脫離微載體后，加入一些新的微載體以增加培養(yǎng)體積，也可在微載體長(zhǎng)滿細(xì)胞后直接加入新的微載體進(jìn)行球傳球接種6)6)細(xì)胞消化與收獲細(xì)胞消化與收獲 通常采用酶消化法收獲細(xì)胞。對(duì)于回收率要求不高的細(xì)胞種類分組沉降簡(jiǎn)單易行,而若要求高回收率,則可用過(guò)濾過(guò)濾方法,采用100m孔徑的尼龍網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、多孔玻璃濾器等將細(xì)胞與微載體分離開(kāi) 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)中空纖維生物反應(yīng)器（hollow fiber bioreactor）是理查德克瑞克（Richard Kncazek）等在1972年發(fā)明的最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的