免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

1、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 常規(guī)組織學(xué)染色技術(shù)概述常規(guī)組織學(xué)染色技術(shù)概述 宏觀宏觀 微觀微觀 超微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu) 基因水平基因水平 組織形態(tài)學(xué)研究技術(shù)的種類：組織形態(tài)學(xué)研究技術(shù)的種類： 一、病理大體組織標(biāo)本的染色方法一、病理大體組織標(biāo)本的染色方法 在標(biāo)本制作中，為了某種特殊目的，突出顯示標(biāo)本的在標(biāo)本制作中，為了某種特殊目的，突出顯示標(biāo)本的重要部分，借助組織切片的特殊染色方法對標(biāo)本進(jìn)行染色，重要部分，借助組織切片的特殊染色方法對標(biāo)本進(jìn)行染色，將病變器官及不同組織成分用染料染成不同的顏色，以便將病變器官及不同組織成分用染料染成不同的顏色，以便于區(qū)分大體標(biāo)本的不同成分和病變特點(diǎn)，如：于區(qū)分大體標(biāo)

2、本的不同成分和病變特點(diǎn)，如： 脂肪組織染色法脂肪組織染色法 目的：主要用于心、肝、腎脂肪變性，動(dòng)脈粥樣硬化大目的：主要用于心、肝、腎脂肪變性，動(dòng)脈粥樣硬化大體標(biāo)本的染色體標(biāo)本的染色 試劑：蘇丹試劑：蘇丹或蘇丹或蘇丹 結(jié)果：病變處脂肪組織呈橙黃色結(jié)果：病變處脂肪組織呈橙黃色 早期心肌梗死染色法早期心肌梗死染色法 目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域 試劑：試劑：0.1% NBT(硝基四唑藍(lán)硝基四唑藍(lán)) / 0.2 mol / L PBS (pH 7.6) 方法：將方法：將2-3 mm 厚新鮮心肌大片放入試劑中，厚新鮮心肌大片放入試劑中，37 C 孵育孵育20 min。 結(jié)果：

3、正常心肌呈藍(lán)色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結(jié)締結(jié)果：正常心肌呈藍(lán)色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結(jié)締 組織、瘢痕組織呈淺藍(lán)色或不顯色。組織、瘢痕組織呈淺藍(lán)色或不顯色。 注意注意 ：新鮮標(biāo)本，尸檢心肌不超過：新鮮標(biāo)本，尸檢心肌不超過6小時(shí)。小時(shí)。 二、光學(xué)顯微鏡下的組織學(xué)染色方法二、光學(xué)顯微鏡下的組織學(xué)染色方法常規(guī)常規(guī)HE染色（染色（hematoxylin and eosin staining）組織學(xué)特殊染色組織學(xué)特殊染色 1. Mallory 三染色、三染色、Masson三染色三染色 2. 神經(jīng)纖維的鍍銀染色神經(jīng)纖維的鍍銀染色 3. 其他的特殊染色，包括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細(xì)胞其他的特殊染色，包

4、括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細(xì)胞DNA和和RNA的染色等的染色等 上述的各種染色方法只能在細(xì)胞水平上顯示組織結(jié)構(gòu)的形上述的各種染色方法只能在細(xì)胞水平上顯示組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)改變。態(tài)改變。三、超微結(jié)構(gòu)的觀察三、超微結(jié)構(gòu)的觀察光線波長的限制，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限為光線波長的限制，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限為0.2 m 有效放大倍數(shù)最高不超過有效放大倍數(shù)最高不超過2000倍。倍。電鏡的分辨率最佳可達(dá)電鏡的分辨率最佳可達(dá)0.14nm，放大倍率最高可達(dá)，放大倍率最高可達(dá)100萬倍。萬倍。 第二節(jié)第二節(jié) 免疫組織化學(xué)染色技術(shù)免疫組織化學(xué)染色技術(shù) Immunohistochemical technique

5、該技術(shù)主要是用于研究和觀察細(xì)胞中的某些結(jié)構(gòu)或分子該技術(shù)主要是用于研究和觀察細(xì)胞中的某些結(jié)構(gòu)或分子物質(zhì)和組織細(xì)胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。物質(zhì)和組織細(xì)胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為：根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為： 1. 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 2. 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 3. 免疫鐵蛋白技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù) 4. 免疫金免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 5. 免疫電子顯微鏡技術(shù)免疫電子顯微鏡技術(shù)一、免疫組織化學(xué)染色方法的原理一、免疫組織化學(xué)染色方法的原理 抗原（抗原（antigen

6、） 1. 定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和效應(yīng)細(xì)疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂邪┰隗w內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂袃煞N性能：兩種性能： （1）免疫原性（）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子具有指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。 （2）反應(yīng)原性（）反應(yīng)原性（reactogenicity）指抗原分子與抗體）指抗原分子與抗體或效應(yīng)或效應(yīng) T 細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)

7、物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。2. 抗原的分類抗原的分類 完全抗原、半抗原完全抗原、半抗原免疫學(xué)分類免疫學(xué)分類 胸腺依賴抗原與非依賴抗原胸腺依賴抗原與非依賴抗原 外源性抗原：微生物、花粉等外源性抗原：微生物、花粉等 內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫 瘤相關(guān)抗原等瘤相關(guān)抗原等臨臨 床床 分分 類類 同種異型抗原：人類白細(xì)胞抗原、同種異型抗原：人類白細(xì)胞抗原、 血型抗原血型抗原 異嗜性抗原：人與其他動(dòng)物、植物異嗜性抗原：人與其他動(dòng)物、植物 等之間存在的共同抗原等之間存在的共同抗原 抗體（抗體（antibody） 1. 定義：機(jī)體受到抗原

8、刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，定義：機(jī)體受到抗原刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，B淋淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白，稱為抗體。泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白，稱為抗體。 大部分抗體電泳后位于大部分抗體電泳后位于 區(qū)帶，區(qū)帶，1972年國際免疫學(xué)年國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)正式將化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似的一類球蛋白分子聯(lián)合會(huì)正式將化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白統(tǒng)一命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。 2. 抗體的種類抗體的種類: 五類，即五類，即IgA、IgD、IgE、Ig

9、G、IgM 免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，使用的抗體主要是免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，使用的抗體主要是IgG，個(gè)，個(gè)別情況下使用別情況下使用IgG的亞型，多為的亞型，多為IgG1。 免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理及顯色原理免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理及顯色原理 1. 免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理 染色反應(yīng)的最基本原理是抗原抗體的反應(yīng)。染色反應(yīng)的最基本原理是抗原抗體的反應(yīng)。 通過對針對標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種通過對針對標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種發(fā)色劑或酶類，再通過激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色發(fā)色劑或酶類，再通過激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生劑，

10、在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色以確定所要檢測的抗原是否存肉眼可觀察到的顏色以確定所要檢測的抗原是否存在。在。 通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測到所要研究的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。即可檢測到所要研究的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。2. 免疫組織化學(xué)染色的顯色原理免疫組織化學(xué)染色的顯色原理 (1) 基本原理基本原理 熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法。其中以熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標(biāo)抗體法應(yīng)用最為廣泛。酶標(biāo)抗體法應(yīng)用最為廣泛。 直接法：是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切直接

11、法：是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切片上待檢測的組織或細(xì)胞中抗原反應(yīng)，再用底物顯色，顯示片上待檢測的組織或細(xì)胞中抗原反應(yīng)，再用底物顯色，顯示出所檢測的目的抗原的部位。出所檢測的目的抗原的部位。 間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。子上，檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。 間接法中所用的一抗是針對組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，間接法中所用的一抗是針對組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。多數(shù)抗體是由家兔制備的多

12、克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。 第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來自同一種屬動(dòng)物，與標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就抗體均來自同一種屬動(dòng)物，與標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就能用來顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接能用來顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩。法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩。 通過某種技術(shù)增加第二抗體上標(biāo)記酶的含量，可提通過某種技術(shù)增加第二抗體上標(biāo)記酶的含量，可提高免疫組織化學(xué)染色的敏感度。高免疫組織化學(xué)染色的敏感度。 IHC技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用。技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用。（2）顯色的基

13、本程序）顯色的基本程序 1抗孵育切片或細(xì)胞涂片抗孵育切片或細(xì)胞涂片 2抗（酶標(biāo)抗體）孵育抗（酶標(biāo)抗體）孵育切片切片 發(fā)色劑顯色發(fā)色劑顯色 （核復(fù)染）（核復(fù)染）（3）酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑）酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑 辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O2 HRP H2O2 HRP H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異的，其余反應(yīng)是非催化的酶促反應(yīng)第一步是特異的，其余反應(yīng)是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應(yīng)特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反

14、應(yīng)的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如：的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如： CN為藍(lán)色為藍(lán)色 TMB為深藍(lán)色為深藍(lán)色 AEC為紅色為紅色 DAB為棕色為棕色 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以以AS-Mx（色酚（色酚AS-MX磷酸鹽）為底物，磷酸鹽）為底物，F(xiàn)B/FR (Fast blue/Fast red)為發(fā)色劑，生成藍(lán)色為發(fā)色劑，生成藍(lán)色 / 紅色不容性沉淀物。紅色不容性沉淀物。 ALP標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的淋巴細(xì)胞等的ICC染色。染色。 由于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性由

15、于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP，在顯色液中需加入終濃度為，在顯色液中需加入終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑的左旋咪唑 (levamisole)，大多數(shù)內(nèi)源性，大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。活性可被抑制。 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為 -D-葡萄糖葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37C孵育孵育1小時(shí)，生小時(shí)，生成藍(lán)色不溶性

16、沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、成藍(lán)色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長期保存。透明后封片，長期保存。 （4）核復(fù)染）核復(fù)染 在顯色后，特別是用在顯色后，特別是用DAB顯色后，顯色后，切片可用蘇木素染料進(jìn)行核復(fù)染，經(jīng)水切片可用蘇木素染料進(jìn)行核復(fù)染，經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的DAB棕色形成對比。但用棕色形成對比。但用AEC顯色后不能用顯色后不能用蘇木素做核復(fù)染，因?yàn)榕渲铺K木素染料蘇木素做核復(fù)染，因?yàn)榕渲铺K木素染料中使用酒精作為介質(zhì)，可使中使用酒精作為介質(zhì)，可使AEC的紅色的紅色終產(chǎn)物褪色，且終產(chǎn)物褪色，且AEC顯

17、色后只能用水溶顯色后只能用水溶性封固劑封片。性封固劑封片。第三節(jié)第三節(jié) 免疫組織化學(xué)染色步驟免疫組織化學(xué)染色步驟（一）（一）ABC或或SP法進(jìn)行石蠟切片染色的主要步驟法進(jìn)行石蠟切片染色的主要步驟 1. 組織材料的采??；組織材料的采??； 2. 組織塊的固定；組織塊的固定； 3. 組織塊的脫水、透明及石蠟包埋；組織塊的脫水、透明及石蠟包埋； 4. 石蠟切片的制備；石蠟切片的制備； 5. 石蠟切片的脫蠟及水化；石蠟切片的脫蠟及水化； 6. 抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性； 7. PBS洗滌切片；洗滌切片； 8. 抗原修復(fù)或蛋白酶消化切片，修復(fù)或暴露抗原；抗原修復(fù)或蛋白酶消化切片，

18、修復(fù)或暴露抗原； 9. PBS洗滌切片；洗滌切片；10.用與二抗來源相同的動(dòng)物非免疫正常血清（或同時(shí)用與二抗來源相同的動(dòng)物非免疫正常血清（或同時(shí) 加入加入BSA）孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；）孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11. 用特異性一抗用特異性一抗(單克隆、多克隆單克隆、多克隆)孵育切片；孵育切片；12. PBS（可加入（可加入Tween 20#，PBST）洗滌切片；）洗滌切片；13. 用針對一抗的生物素化的二抗孵育切片；用針對一抗的生物素化的二抗孵育切片；14. 用用PBS或或PBST洗滌切片；洗滌切片；15. 滴加滴加SP試劑或試劑或ABC試劑；試劑；16. PBS或或PB

19、ST洗滌切片；洗滌切片；17. DAB或或AEC顯色；顯色；18. 自來水洗滌切片，終止顯色；自來水洗滌切片，終止顯色；19. 用蘇木素做核復(fù)染；用蘇木素做核復(fù)染；20. 切片脫水、透明，樹膠封片。切片脫水、透明，樹膠封片。（二）各染色步驟的具體操作及注意事項(xiàng)（二）各染色步驟的具體操作及注意事項(xiàng)1. 組織材料的采取組織材料的采取 活檢組織活檢組織 組織標(biāo)本組織標(biāo)本 手術(shù)切除標(biāo)本手術(shù)切除標(biāo)本 尸檢標(biāo)本尸檢標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)組織或培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組織或培養(yǎng)細(xì)胞 活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織 體積小，因活檢鉗直接鉗取，常受壓過度而變

20、性，因此，體積小，因活檢鉗直接鉗取，常受壓過度而變性，因此， 活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時(shí)應(yīng)采取主要的病活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時(shí)應(yīng)采取主要的病灶區(qū)。灶區(qū)。 抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)考慮切取主要病抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)考慮切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠(yuǎn)距病灶的正常區(qū)。灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠(yuǎn)距病灶的正常區(qū)。 尸檢組織尸檢組織 由于取材時(shí)一般均已超過死亡后由于取材時(shí)一般均已超過死亡后2小時(shí)以上，組織有不同程度小時(shí)以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消失或有嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多自溶，其抗原或變性

21、消失或有嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多在在24小時(shí)以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴(yán)重，而影響小時(shí)以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴(yán)重，而影響染色結(jié)果。手術(shù)切除的組織較新鮮，取材后應(yīng)立即固定，以保存染色結(jié)果。手術(shù)切除的組織較新鮮，取材后應(yīng)立即固定，以保存組織結(jié)構(gòu)和抗原。組織結(jié)構(gòu)和抗原。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本 新鮮，可按需要取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織結(jié)構(gòu)新鮮，可按需要取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織結(jié)構(gòu)和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學(xué)染色。和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學(xué)染色。取材標(biāo)本的大小取材標(biāo)本的大小 尸檢組織材料大小以尸檢組織材料大小以1cm 1

22、cm 0.2cm 為宜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用為宜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標(biāo)本體積不宜大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標(biāo)本體積不宜過大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費(fèi)試劑。過大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費(fèi)試劑。 2. 組織塊的固定、水洗組織塊的固定、水洗（1）固定液：種類較多，常用的有以下）固定液：種類較多，常用的有以下2種：種： 4% 甲醛甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：配制方法： 10 ml 40% 甲醛甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，

23、形成白色沉淀(多聚甲醛多聚甲醛)，還，還可形成甲酸，影響染色結(jié)果?？尚纬杉姿幔绊懭旧Y(jié)果。(可以用粉筆溶可以用粉筆溶) 4% 多聚甲醛多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：配制方法：40g多聚甲醛多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4)，攪拌、加熱至，攪拌、加熱至60 C，同時(shí)滴入，同時(shí)滴入1N NaOH 至溶液完全透明。冷卻后用至溶液完全透明。冷卻后用1N HCl 調(diào)調(diào)PH 值至值至7.2-7.4，再用，再用0.1mol/L PB將溶液加至將溶液加至1000ml。 固定時(shí)間：一般根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定

24、固定時(shí)間：一般根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定2-24小時(shí)。小時(shí)。 固定原理：甲醛通過使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。固定原理：甲醛通過使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。 甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反應(yīng)，并能保存脂類和類脂體。甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反應(yīng)，并能保存脂類和類脂體。 不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測的不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測的 抗原決定簇被封閉，影響抗原抗體的結(jié)合?？乖瓫Q定簇被封閉，影響抗原抗體的結(jié)合。（2）水洗）水洗 沖洗時(shí)間與標(biāo)本的種類、組織塊的大小和固定時(shí)沖洗時(shí)間與標(biāo)本的種類、組織塊的大小和固定時(shí) 間長短有關(guān)。尸檢組織和大動(dòng)物組織一般沖洗

25、間長短有關(guān)。尸檢組織和大動(dòng)物組織一般沖洗24 小時(shí)，小動(dòng)物組織沖洗小時(shí)，小動(dòng)物組織沖洗2-10小時(shí)。小時(shí)。 新鮮標(biāo)本固定時(shí)間短，沖洗時(shí)間也相應(yīng)縮短，固新鮮標(biāo)本固定時(shí)間短，沖洗時(shí)間也相應(yīng)縮短，固 定時(shí)間長的標(biāo)本，沖洗時(shí)間也需延長。定時(shí)間長的標(biāo)本，沖洗時(shí)間也需延長。 沖洗時(shí)組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎沖洗時(shí)組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎 緊，防止組織塊漏出。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端緊，防止組織塊漏出。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端 接自來水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)⒔幼詠硭?，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)?組織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。組織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。 對于

26、過小組織或穿刺組織和小動(dòng)物組織多次換水對于過小組織或穿刺組織和小動(dòng)物組織多次換水 浸泡即可。浸泡即可。3. 組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋（1）脫水）脫水 脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。精。 酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強(qiáng)，并酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強(qiáng)，并可硬化組織。酒精對組織的穿透速度很快，對組織可硬化組織。酒精對組織的穿透速度很快，對組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過度收縮，應(yīng)從有較明顯的收縮作用。為避免組織過度收縮，應(yīng)從低濃度開始，然后再依次增加其濃度。在常溫下或低濃度開始，

27、然后再依次增加其濃度。在常溫下或4 C下進(jìn)行，以減少抗原的損失。下進(jìn)行，以減少抗原的損失。 70% 80% 90% 95% 100% 100% （2）透明）透明 為使石蠟?zāi)芙虢M織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過為使石蠟?zāi)芙虢M織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟的溶劑。通過一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟的溶劑。通過溶劑的媒介作用而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。溶劑的媒介作用而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。 透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用 二甲苯。二甲苯。 一般經(jīng)過一般經(jīng)過23次純二甲苯溶液透明，每次次純二甲苯溶液透明，每次10

28、 15分鐘，同時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二分鐘，同時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二甲苯的新鮮程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬。甲苯的新鮮程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬。（3）浸蠟）浸蠟 組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟。組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟。 為使石蠟充分滲入組織只，常需經(jīng)過為使石蠟充分滲入組織只，常需經(jīng)過2-3次石蠟浸漬。次石蠟浸漬。 用于免疫組織化學(xué)染色的組織塊浸蠟應(yīng)使用低溫蠟，用于免疫組織化學(xué)染色的組織塊浸蠟應(yīng)使用低溫蠟，在在60 C以下浸透。以下浸透。（4）包埋）包埋 浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔

29、化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。盒，冷卻后取出，修塊。4. 石蠟切片的制作石蠟切片的制作（1）載玻片涂片的制作）載玻片涂片的制作 防 脫 片 劑 ：防 脫 片 劑 ： 3 - 氨 基 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 （氨 基 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 （ 3 -aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚賴氨酸）、多聚賴氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛）、甲醛-甘油明膠。甘油明膠。 APES 涂片的制作涂片的制作 原理：原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學(xué)修飾作用，

30、改變其表面不同，它是通過對玻璃表面起化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易脫落，保留時(shí)間較久。脫落，保留時(shí)間較久。 具體操作方法：具體操作方法： 將載玻片用酸處理后，用將載玻片用酸處理后，用95%酒精浸泡，再用綢布酒精浸泡，再用綢布擦干，清除表面的污漬；擦干，清除表面的污漬； 將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)5min； 將載玻片用鑷子夾住浸入將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑（試劑（1ml APES+50ml丙酮）丙酮）1-2次；次； 純丙酮內(nèi)洗純丙酮內(nèi)洗2次后，次后，37 C過夜，干燥；過夜

31、，干燥； 用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。 多聚賴氨酸（多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，PLL） 試劑配制：試劑配制：PLL 0.5g + 蒸餾水蒸餾水 100 ml 也可根據(jù)提供的方法配制。可于也可根據(jù)提供的方法配制?？捎? C或或- 20 C 保存保存?zhèn)溆?，可反?fù)凍存，效果無明顯影響。備用，可反復(fù)凍存，效果無明顯影響。 涂片前將其稀釋涂片前將其稀釋10-50倍，均勻涂在處理后干凈的載玻倍，均勻涂在處理后干凈的載玻 片上，片上，37 C下干燥過夜。下干燥過夜。甲醛甲醛-甘油明膠甘油明膠 試劑：試劑：40%甲醛甲醛 2.5ml，明膠，明膠0.5g

32、，蒸餾水加至，蒸餾水加至100ml。 配制方法：用一部分蒸餾水（約配制方法：用一部分蒸餾水（約80ml）加熱溶解明）加熱溶解明 膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至 100ml，混勻即可。，混勻即可。 粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復(fù)或酶消化后，有時(shí)易脫片。原熱修復(fù)或酶消化后，有時(shí)易脫片。（2）制做切片）制做切片 切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)式或滑動(dòng)式切片機(jī)。切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)式或滑動(dòng)式切片機(jī)。 切片厚度：切片厚度：5-7 m。 展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展 開

33、切片（水浴鍋上加熱平皿）。開切片（水浴鍋上加熱平皿）。 撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。 切片干燥：切片干燥： 37 C過夜，干燥。過夜，干燥。 5石蠟切片的脫臘及水化石蠟切片的脫臘及水化 脫蠟：脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯將切片放入染色筐中，二甲苯 、 各各15分鐘脫臘，分鐘脫臘， 水化：水化：100%酒精酒精、中各中各10分鐘、分鐘、95% ALC 5分分鐘、鐘、90% ALC 5分鐘、分鐘、80% ALC 5分鐘、分鐘、70% ALC 5分鐘，蒸餾水浸洗。分鐘，蒸餾水浸洗。6清除內(nèi)源性過氧化物酶活性清除內(nèi)源性過氧化物酶活性 由于常規(guī)免疫組織

34、化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過由于常規(guī)免疫組織化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過氧化物酶氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和和DAB (3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而組織中常含有，而組織中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽性反應(yīng)和減少背景內(nèi)源性過氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽性反應(yīng)和減少背景染色，需要先清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。染色，需要先清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。 染染 色色 框框 具體方法：將切片置入甲醇具體方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2 液中液中2030分鐘分鐘 試劑：純甲醇試劑：純甲醇 99 ml

35、 30%，H2O2 1ml 充分混勻，使最后濃充分混勻，使最后濃 度為度為0.3%，或，或0.01ml PBS (pH 7.27.4) 99ml 30% H2O2 1ml7PBS洗滌切片洗滌切片 經(jīng)甲醇經(jīng)甲醇- H2O2或或PBS-H2O2 處理后的切片先用蒸餾水洗一次處理后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用再用PBS洗洗5min3次。次。 0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配制：的配制： NaH2PO4 2H2O 0.45 g Na2HPO4 12H2O 3.23g NaCl 8.0g 蒸餾水蒸餾水 加至加至1000 ml 為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，

36、可在為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，可在PBS中加入中加入Tween 20#，制成含，制成含0.1% Tween 20# 的的PBS。Tween 20# 為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。 8抗原修復(fù)（抗原修復(fù)（antigen retrieval, AR） 某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋肌中的肌中的myoglobin (Mb)、actin、myosin、腦組織中的、腦組織中的S-100蛋白、蛋白、GFAP、血型抗原、血型抗原A、B、H、生長激素、生長激素(gr

37、owth hormone)、胰島、胰島素、波形蛋白素、波形蛋白(vimentin)、降鈣素、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗等。但有一部分抗原物質(zhì)或檢測的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，原物質(zhì)或檢測的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復(fù)或蛋白酶消化。將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復(fù)或蛋白酶消化。 目前機(jī)理清楚，但是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切目前機(jī)理清楚，但是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗(yàn)表明，可以提高抗原抗體陽性檢測片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗(yàn)表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽性，現(xiàn)已

38、廣泛用于技術(shù)中。尤其對原率，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽性，現(xiàn)已廣泛用于技術(shù)中。尤其對原來僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，利用后大部分抗體能用于常來僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，利用后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。 （1）抗原熱修復(fù)）抗原熱修復(fù) 方方 法法 微波中微波中 96 1020 min 直接加熱法直接加熱法 100 10 min 高壓鍋高壓鍋 / 消毒鍋消毒鍋 120 10 min 其他：水浴鍋其他：水浴鍋 100 10 min2 及真空加熱及真空加熱 10 min 等。等。 熱修復(fù)的介質(zhì)熱修復(fù)的介質(zhì) 0.01 mol/L pH 6.0 檸檬酸緩沖液檸檬酸緩沖液 0.05

39、 mol/L Tris-HCl 緩沖液緩沖液 (pH 112) 0.01 mol/L pH 7.0 PBS 2 % 硫酸鋁硫酸鋁 2 % 硝酸鉛硝酸鉛 生理鹽水生理鹽水 蒸餾水蒸餾水 溶液的摩爾濃度對修溶液的摩爾濃度對修復(fù)效果無任何影響，而復(fù)效果無任何影響，而pH值則影響較大，緩沖值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。緩沖液較常用。 溫度與修復(fù)時(shí)間的關(guān)系：溫度與修復(fù)時(shí)間的關(guān)系： 許多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溫度高修復(fù)時(shí)間短，如許多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溫度高修復(fù)時(shí)間短，如Ki-67和和P-gp的檢的檢測，利用同一切片，達(dá)到相同染色結(jié)果需要：測，利用同一切片，達(dá)到

40、相同染色結(jié)果需要： 100 20min； 90 30min； 80 50min； 70 20h 操作流程操作流程 微波處理：將切片插入微波處理：將切片插入25 片塑料架上，在片塑料架上，在250 ml塑盒內(nèi)加入塑盒內(nèi)加入200 ml緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90+，取出后自然冷，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。洗。 水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，首先調(diào)節(jié)水溫達(dá)水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，首先調(diào)節(jié)水溫達(dá) 95左右，左右，將切片置入內(nèi)含將切片置入內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入水浴鍋，溫緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入

41、水浴鍋，溫度平衡后開始計(jì)算時(shí)間度平衡后開始計(jì)算時(shí)間20 min，取出容器后自然冷卻到室溫。，取出容器后自然冷卻到室溫。 壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加熱鍋使壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開始冒氣計(jì)時(shí)開始冒氣計(jì)時(shí)50 min，關(guān)閉氣閥，使之加壓，關(guān)閉氣閥，使之加壓10 min。再將壓力。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗鍋置于流水槽中沖洗10 min，冷卻后取出切片，冷卻后取出切片，PBS洗。洗。 最佳修復(fù)方法的選擇最佳修復(fù)方法的選擇 選擇最佳的修復(fù)方法設(shè)

42、計(jì)表選擇最佳的修復(fù)方法設(shè)計(jì)表 檸檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 10-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3壓力鍋120 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴90 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作對照，不作任何處理 抗原熱修復(fù)應(yīng)注意的問題抗原熱修復(fù)應(yīng)注意的問題 有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示，對某些應(yīng)表達(dá)

43、在胞漿切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示，對某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)。而有或膜上的抗原，經(jīng)修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)。而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，因此，些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，因此，在使用該方法時(shí)一定要小心，對結(jié)果的判定也要做出客在使用該方法時(shí)一定要小心，對結(jié)果的判定也要做出客觀的分析，同時(shí)在操作過程中還注意以下問題：觀的分析，同時(shí)在操作過程中還注意以下問題： 熱處理后應(yīng)自然冷卻切片。熱處理后應(yīng)自然冷卻切片。 不能煮干修復(fù)液。不能煮干修復(fù)液。 不要任何抗原的檢測都使用該方法。不要任何抗原的檢測都使用該方法。 一批抗原的檢測其溫度和

44、時(shí)間應(yīng)保持一致。一批抗原的檢測其溫度和時(shí)間應(yīng)保持一致。 一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，但對細(xì)胞核的影響較大，一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，但對細(xì)胞核的影響較大，會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。 如果在常用的緩沖（修復(fù)）液中無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，得不出如果在常用的緩沖（修復(fù)）液中無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，得不出好的染色結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不好的染色結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或或EGTA等可能取得較等可能取得較好的效果。好的效果。 （2）蛋白酶消化法）蛋白酶消

45、化法 原原 理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開而引起暴露抗原決定簇的作用，使聯(lián)被酶消化打開而引起暴露抗原決定簇的作用，使第一抗體能與抗原部分結(jié)合，提高陽性檢測率。第一抗體能與抗原部分結(jié)合，提高陽性檢測率。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：用于用于IHC切片消化的酶有多種，所選擇酶的切片消化的酶有多種，所選擇酶的種類、使用的濃度、種類、使用的濃度、pH值、消化時(shí)間及溫度等均要視組值、消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而織固定的

46、不同、所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。異，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。 常用的消化酶類：常用的消化酶類： 胰蛋白酶和蛋白酶胰蛋白酶和蛋白酶K：檢測細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化，如：檢測細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化，如 Keratin、CEA、GFAP等。等。 胃蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測切片的消化，如纖連胃蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測切片的消化，如纖連蛋白蛋白 (fibronectin)，各型膠原等。，各型膠原等。 消化時(shí)間及溫度：消化時(shí)間及溫度：一般消化時(shí)間與組織固定的長一般消化時(shí)間與組織固定的長短呈正比。蛋白酶的消化時(shí)間短呈正比。蛋白酶的消化時(shí)間51020min，視切片，視切片固定時(shí)間的長短而定。固定

47、時(shí)間的長短而定。（3）酶消化液的配制）酶消化液的配制 除了商業(yè)銷售的成品，可按說明書使用外，還可自除了商業(yè)銷售的成品，可按說明書使用外，還可自行配制。行配制。 0.1% 胰蛋白酶胰蛋白酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 0.1g 0.1% 氯化鈣氯化鈣 (pH 7.8) 100 ml 配制方法：先配制配制方法：先配制0.1%的的CaCl2，用，用0.1mol/L 的的NaOH將其將其pH調(diào)至調(diào)至7.8，然后加入胰蛋白酶，然后加入胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前將，溶解之。用前將胰蛋白酶液過濾，并在水浴中預(yù)熱至胰蛋白酶液過濾，并在水浴中預(yù)熱至37，室溫下消化時(shí)，室溫下消化時(shí)間間530min，多用于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴

48、露。，多用于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴露。 0.4 % 胃蛋白酶胃蛋白酶 胃蛋白酶胃蛋白酶 400 mg 0.1N HCl 100 ml 多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化，多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化， 37下消化時(shí)下消化時(shí)間約間約30 min。 0.06 % 蛋白酶蛋白酶K 蛋白酶蛋白酶K 0.06 g 0.05mol/L Tris-HCl (PH7.5) 100 ml 用法同上。用法同上。 在免疫組化染色中，有時(shí)經(jīng)過度固定的標(biāo)本，影響一抗與在免疫組化染色中，有時(shí)經(jīng)過度固定的標(biāo)本，影響一抗與抗原的結(jié)合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。抗原的結(jié)合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的

49、作用。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異?？傊诒３纸M織形態(tài)不破壞消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異?？傊?，在保持組織形態(tài)不破壞的前提下，宜盡量消化時(shí)間延長。以上三種酶消化液，以第一的前提下，宜盡量消化時(shí)間延長。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。種最為常用。 9. 經(jīng)熱修復(fù)抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進(jìn)行下一步。經(jīng)熱修復(fù)抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進(jìn)行下一步。10. 用與制備二抗相同的動(dòng)物非免疫血清孵育切片防止一抗的非用與制備二抗相同的動(dòng)物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。特異性吸附。 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色。組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染

50、色。 最常見的原因是蛋白最常見的原因是蛋白 (第一抗體第一抗體) 吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。成分上。 最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體相同動(dòng)物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一相同動(dòng)物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合抗體的非特異性結(jié)合 (在室溫下進(jìn)行在室溫下進(jìn)行)。 非免疫血清的稀釋度非免疫血清的稀釋度1:51:20，還可加入，還可加入BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非免疫血清中含使稀釋后的非免疫血清中含0

51、.16%的的BSA，可取得，可取得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。特異性背景染色的有效方法。 11用特異性一抗孵育切片用特異性一抗孵育切片 研究組織細(xì)胞中的某種抗原是否存在，應(yīng)用免疫組化染色，研究組織細(xì)胞中的某種抗原是否存在，應(yīng)用免疫組化染色，就要選用針對這種抗原的特異性抗體?，F(xiàn)在國際上有許多公司就要選用針對這種抗原的特異性抗體?，F(xiàn)在國際上有許多公司生產(chǎn)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套生產(chǎn)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者

52、可根據(jù)一抗的的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。 一抗的種屬來源一抗的種屬來源 一抗可來源于各種種屬的動(dòng)物，常見是來自家兔、山羊或小鼠，一抗可來源于各種種屬的動(dòng)物，常見是來自家兔、山羊或小鼠，偶見來自馬。一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的偶見來自馬。一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗體，抗體，而來自小鼠的多是單克隆的而來自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或標(biāo)本種屬抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或標(biāo)本種屬的不同，選擇針對大鼠、小鼠或人的抗體。的不同，選擇針對大鼠、小鼠或人的抗體。

53、抗體劑型及滴度檢驗(yàn)抗體劑型及滴度檢驗(yàn) 我國現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國外進(jìn)口，包括一抗和含二我國現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國外進(jìn)口，包括一抗和含二抗的試劑盒?？沟脑噭┖?。 國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是100-200 g/ml，但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口，但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)行了分裝，如分成的原裝抗體又進(jìn)行了分裝，如分成0.1-0.2ml/瓶等，也經(jīng)銷瓶等，也經(jīng)銷1ml/瓶抗體，瓶抗體，價(jià)格各不相同。價(jià)格各不相同。 國內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進(jìn)口抗體進(jìn)行稀釋，銷售的品種又分為即用國內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進(jìn)口抗體進(jìn)行稀釋，銷售的品種又分為即用型和濃縮型型和濃縮型(

54、進(jìn)口原裝的抗體進(jìn)口原裝的抗體)兩種。兩種。 在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋，直接在切在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋，直接在切片上滴加即可。片上滴加即可。 濃縮型必須在稀釋后才能使用，因?yàn)闈饪s型抗體濃度高，可引起嚴(yán)重的濃縮型必須在稀釋后才能使用，因?yàn)闈饪s型抗體濃度高，可引起嚴(yán)重的非特異性染色，因此，必須在正式染色前先用切片對不同滴度的抗體染非特異性染色，因此，必須在正式染色前先用切片對不同滴度的抗體染色效果進(jìn)行評價(jià)，選擇濃度強(qiáng)度最好，非特異性反應(yīng)（背景染色）最低色效果進(jìn)行評價(jià)，選擇濃度強(qiáng)度最好，非特異性反應(yīng)（背景染色）最低的抗體稀釋度來進(jìn)行正式染色。的

55、抗體稀釋度來進(jìn)行正式染色。 一抗稀釋滴度的評價(jià)一抗稀釋滴度的評價(jià)（摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)可以稀釋度跨度大一些試）（摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)可以稀釋度跨度大一些試）切片編號 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5抗體稀釋度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800特異性染色 + + + + + + + + + + + + + + +背景染色 + + + + + 一抗體的稀釋一抗體的稀釋 一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即0.01mol/L PBS pH 7.2-7.4，為進(jìn)一步保證減少背景染色，用于

56、稀釋一抗的，為進(jìn)一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應(yīng)加入制中也應(yīng)加入制備二抗的同種動(dòng)物的非免疫正常血清，有條件的還可加入備二抗的同種動(dòng)物的非免疫正常血清，有條件的還可加入BSA，兩者的，兩者的濃度在濃度在1-2-5% 即可。即可。 一抗的孵育時(shí)間及條件一抗的孵育時(shí)間及條件 加入適當(dāng)稀釋的一抗的切片，可在常溫下或加入適當(dāng)稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37下保溫盒內(nèi)孵育。下保溫盒內(nèi)孵育。經(jīng)過正常二抗同種動(dòng)物非免疫血清孵育后的切片不能用經(jīng)過正常二抗同種動(dòng)物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體去除多余的非免疫血清后，直接

57、向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵。孵育時(shí)間：育時(shí)間：30-60分鐘或更長。分鐘或更長。 如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于于4冰箱內(nèi)過夜孵育，可達(dá)到滿意的效果。冰箱內(nèi)過夜孵育，可達(dá)到滿意的效果。 12PBS洗滌切片洗滌切片 將用一抗孵育后的切片用將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌洗滌3次，每次次，每次5min，用冷，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反應(yīng)。洗滌，可減少非特異性反應(yīng)。13用針對一抗的生物素化二抗孵育切片用針

58、對一抗的生物素化二抗孵育切片 根據(jù)一抗的種屬來源，選擇相應(yīng)的二抗。如：一抗是家兔抗某根據(jù)一抗的種屬來源，選擇相應(yīng)的二抗。如：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接使用。濃縮型者一般用用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接使用。濃縮型者一般用PBS直直接以接以1: 200- 400倍稀釋使用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育倍稀釋使用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60min。 試劑盒：濃縮型或即用型試劑盒：濃縮型或即用型 SP試劑盒、試劑盒、ABC試劑盒試劑盒 試劑盒中包含：內(nèi)源性過氧化物酶

59、阻斷劑試劑盒中包含：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑 二抗的同種動(dòng)物非免疫血清二抗的同種動(dòng)物非免疫血清 生物素標(biāo)記的抗生物素標(biāo)記的抗IgG抗體（二抗）抗體（二抗） SP試劑試劑 ABC試劑（單獨(dú)購買）試劑（單獨(dú)購買）14PBS洗滌切片洗滌切片5min3次次15滴加滴加SP試劑或試劑或ABC試劑試劑（1）生物素）生物素-抗生物素染色（抗生物素染色（SABC或或SP法）的顯色原理法）的顯色原理 ABC法的染色原理法的染色原理 很早以前研究者就注意到給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白，會(huì)引很早以前研究者就注意到給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白，會(huì)引起明顯的起明顯的“維生素維生素H 缺乏癥缺乏癥”，也稱為，也稱為“蛋白質(zhì)傷害蛋白質(zhì)傷

60、害”。經(jīng)研。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68 kD，屬，屬于糖蛋白，當(dāng)時(shí)命名為卵白素（于糖蛋白，當(dāng)時(shí)命名為卵白素（avidin）。機(jī)體中還有一種物）。機(jī)體中還有一種物質(zhì)叫維生素質(zhì)叫維生素H，又稱為生物素（，又稱為生物素（biotin），是一種小分子的維），是一種小分子的維生素，廣泛分布于動(dòng)植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化生素，廣泛分布于動(dòng)植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化酶反應(yīng)，分子量為酶反應(yīng)，分子量為244 D。 卵白素具有卵白素具有4個(gè)同個(gè)同Vitamin H（生物素）親和力極高的結(jié)合（生物素）親和力極高的結(jié)合點(diǎn)。給動(dòng)物