淺談生殖支原體檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

1、淺談生殖支原體檢測(cè)方法的研究進(jìn)展    自Tully等1981年首次從非淋菌性尿道炎男性患者的尿道分泌物中分離培養(yǎng)出2株生殖原體（Mycoplasma genitalun,Mg）以后，許多學(xué)者對(duì)Mg的生長(zhǎng)特性、免疫學(xué)特性、分子生物學(xué)特性以及與疾病的關(guān)系等進(jìn)行了大量的研究并建立了多種Mg的檢測(cè)方法，本文就Mg的檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。2 血清學(xué)方法 根據(jù)Mg的免疫學(xué)特性，人們建立了用檢測(cè)Mg抗體和檢測(cè)與鑒定Mg抗原的血清學(xué)方法。 Furr等于1984年詳細(xì)報(bào)道了檢測(cè)Mg抗體的MIF技術(shù)。Moller等對(duì)31例未檢測(cè)出Ct和Mh血清抗體的急性盆腔炎患者

2、，用MIF檢測(cè)Mg抗體，發(fā)現(xiàn)其中大約40%在發(fā)病后一個(gè)月內(nèi)抗體滴度有4倍或4倍以上的改變。Taylor-Robinson等報(bào)道應(yīng)用間接MIF檢測(cè)NGU患者M(jìn)g抗體，認(rèn)為間接MIF試驗(yàn)是一種具有足夠敏感性、特異性和簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法。Jensen等曾用EIA檢測(cè)有尿道炎癥與無尿道炎癥狀的男性STD患者急性期血樣標(biāo)本中Mg抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性較弱，且與Mp存在廣泛的交叉反應(yīng)。 根據(jù)特異性抗體能阻止支原體的生長(zhǎng)及代謝這一特性，可采用已知高價(jià)血涉及進(jìn)行祖先生長(zhǎng)及代謝抑制試驗(yàn)以鑒別支原體。趙季文等曾采用MIT鑒定所分離獲得的Mg菌株。 暴露于支原體表面的脂結(jié)合膜蛋白（lipid-associated m

3、embrane proteins,LAMPs是一種支原體種屬特異性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原體，其LAMP抗體具有高度種屬特異性，與其它種屬無交叉反應(yīng)。）因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法檢測(cè)Mg抗體，可消除Mg與Mp之間的交叉反應(yīng)。3 分子生物學(xué)方法 DNA探針和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)Mg的方法，克服了前兩類檢測(cè)方法的弊端，為研究Mg與疾病的病因?qū)W關(guān)系提供了有力的手段。 3.1 DNA探針技術(shù) 1987年Hyman用PUCB載體構(gòu)建成Mg基因文庫，并從中篩選制備出特異性DNA探針，通過斑點(diǎn)雜交，可檢測(cè)僅含0.1 ng的特異性支原體DNA，即105CFU。 3.2 聚合酶鏈

4、反應(yīng)（PCR）技術(shù) PCR是一種新的基因診斷技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，且快速、簡(jiǎn)便。1990年，PCR技術(shù)開始在醫(yī)學(xué)支原領(lǐng)域應(yīng)用。 早期的引物多參照菌體末端特異性粘附蛋白的DNA序列而設(shè)計(jì)。Palmer等體外擴(kuò)增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列，3株Mg均出現(xiàn)37bp的DNA片斷，并證明PCR技術(shù)可檢測(cè)到10-15g的 mg-DNA，其引物序列的： mg1:5TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3 mg2:5CTG CTT TGG TCA AGA CAT CA3 1991年Jensen等16根據(jù)Mg的粘附蛋白基因設(shè)計(jì)合成了如下組引物： mgPa-1 5AGA TGA TGA AAC

5、CCT AAC CCC TTG G3 mgPa-1 5GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3 mgPa-1 5CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3 用MgPa-1 和MgPa-3成功地?cái)U(kuò)增出Mg的281bpDNA片段，5個(gè)臨床分離株擴(kuò)增出同樣的產(chǎn)生，而其他支原體和細(xì)菌均為陰性，用MgPa-2作探針，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Southern eP印跡雜交，均為陽性，證明引物具有特異性，共檢出下降大約有50個(gè)Mg細(xì)胞。1993年Jensen等17又根據(jù)Mg粘膜蛋白基因設(shè)計(jì)了另一對(duì)引物，即： mg粘附蛋白基因設(shè)計(jì)了另一對(duì)引物，即： mgPa-476：5ATG

6、 GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3 mgPa-903：5TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC TAA TGC3 用來證實(shí)和補(bǔ)充引物MgPa-1和MgPa-3所擴(kuò)增的結(jié)果，其擴(kuò)增片段為453bp。研究發(fā)現(xiàn)，這兩對(duì)Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用這種方法檢測(cè)99例尿道炎病人的尿道拭子，結(jié)果17例Mg陽性，而用培養(yǎng)法無一例陽性。 1994年 Jensen擴(kuò)增Mg粘附蛋白基因序列并測(cè)序表明：該序列在Mg條件之間有明顯異質(zhì)性，為此，Jensen等學(xué)者根據(jù)原體屬性高度保守區(qū)域16SrRNA的基因序列，設(shè)計(jì)了種特異性PCR引物，以期檢測(cè)臨床標(biāo)本中所有M

7、g的感染：其引物序列為： Mg-1，5GAA TGA CTC TAG CAG GCA ATG GCTG3 Mg-2，5ATT TGC TGC TCA CTT TTA CAA GTT GGCT3 4種臨床標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mg粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN基因序列則是100%同源，將兩種引物PCR結(jié)合，還可在可疑陽性標(biāo)本中檢測(cè)出10-50個(gè)Mg基因拷貝以下的Mg基因，即以16SrRNA基因?yàn)榘谢虻腜CR系統(tǒng)在保證長(zhǎng)期特異性基礎(chǔ)上更為靈敏。 趙季文等采用Palmer設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增 mg37bpDNA片段，檢測(cè)三種人群的Mg，結(jié)果是性亂人群陽性率為25.26%，性病人群為12.33

8、%，而健康人群為3.85%?？追睒s等采用Jensen設(shè)計(jì)的MgPa-1和MgPa-3，擴(kuò)增Mg281bpDNA片段，檢測(cè)結(jié)果是性亂婦女Mg檢出率為10.2%，STD患者為4.0%。 1998年，糜祖煌等研究報(bào)道了分別以Mg粘附蛋白和16rRNA基因?yàn)榘谢蚪⒌亩N套式PCR檢測(cè)技術(shù)，前者擴(kuò)增生Mg的374bpDNA片段，后者擴(kuò)增產(chǎn)生241bpDNA片段。套式PCR不僅提高了靈敏度，而且因采用兩對(duì)不同的引物，特性也進(jìn)一步的得到提高。用這些法檢測(cè)40例女性STD患者，發(fā)現(xiàn)Mg陽性12例，陽性率30%，檢出陽性率均高于普通PCR法。4 小結(jié) 微生物感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)法，然而Mg培養(yǎng)成功率極低，有待于對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的研究和改良，以促進(jìn)Mg在其中的生長(zhǎng)；此外，將細(xì)胞株引入Mg的培養(yǎng)可能是一個(gè)較好的方法，有必要加強(qiáng)這方面的探索和研究。免疫學(xué)檢測(cè)方法因支原體種屬間易出現(xiàn)交叉反應(yīng)以及對(duì)抗原、抗體純度要求較高而在實(shí)際應(yīng)用上受到一定限制，若能研究建立快速、靈敏、特異的檢測(cè)臨床標(biāo)本中Mg抗原的方法，則具有較大的實(shí)用價(jià)值。PCR技術(shù)是一個(gè)簡(jiǎn)單而又直接的檢測(cè)Mg方法，正被日益廣泛地采用，主要用于Mg感染的早期診斷或急性感染的診斷及各種人群中Mg的流行病學(xué)研